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研究背景和目的:糖尿病神经病理痛（DNP）是糖尿病最常见且难治的并发症。糖尿病周围神经病变导致糖尿病神经病理痛。卫星胶质细（SGC）包裹背根神经节（DRG）中的神经元胞体。SGC中存在多种神经递质及生物分子作用的受体。DRG中SGC上表达嘌呤能2（P2）Y12受体。DRG中神经元和SGC均释放三磷酸腺苷（ATP）。DRG有ATP及其类似物可作用于P2X离子通道受体和P2Y代谢性受体。ATP可介导神经元与胶质细胞间的双向信息交流。外周炎症增加SGC对初级感觉神经节中ATP的敏感性。ATP及ADP可激活P2Y12受体,进而参与痛信号的传递。炎性刺激可激活SGC,SGC的激活在DNP的发病机制中起重要作用。姜黄素具有抗炎和抗氧化功能。因姜黄素在体内的代谢稳定性差且生物利用度低等缺点,限制了其临床应用。采用姜黄素纳米粒可改善其靶向作用和生物利用度。姜黄素纳米粒对大鼠背根神经节SGC中P2Y12受体介导的DNP是否产生作用尚不清楚。本论文第一部分研究目的是应用糖尿病神经病理痛模型,观察姜黄素纳米粒对大鼠背根神经节SGC中P2Y12受体介导DNP的作用,为DNP的防治新方法提供实验基础。代谢综合征（metabolic syndrome,MS）是以中心性肥胖、糖尿病或糖调节受损、高血压、血脂异常以及胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）为共同病理生理基础,以多种代谢性疾病合并出现为临床特点的一组临床症候群。高脂血症与肥胖所致代谢综合征日益增多,是代谢综合征的发病基础。高脂血症可产生细胞毒作用,导致周围神经结构和功能改变。天然药物单体有效成分槲皮素（quercetin）具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用。实验室前期实验证明槲皮素可有效缓解DNP。本研究第二部分探索槲皮素对高脂模型大鼠背根神经节SGC中P2Y12受体介导的神经病理损伤的作用及可能机制,为高脂血症（hyperlipidemia,HLP）引起的神经损伤防治提供新的实验依据。第一部分方法:1.载体（PDAEMA）的制备采用可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）方法获得。2.姜黄素纳米粒对DM神经病理痛模型大鼠的影响实验:将大鼠随机分为正常对照组（Ctrl）、II型糖尿病模型组（DM）、DM模型合并姜黄素纳米粒处理组（DM+nano curcumin）、DM模型合并空载纳米粒处理组（DM+nano carrier）。检测血糖和体重观察姜黄素纳米粒处理对大鼠DM病理变化的影响。动物行为学方法检测各组大鼠机械刺激缩足反应阈值（MWT）和热刺激缩足反应潜伏期（TWL）的变化情况。用实时定量PCR（Q-PCR）、蛋白印迹（Western Blot）检测静脉注射姜黄素纳米粒对P2Y12受体,IL-1β、Cx43的mRNA和蛋白表达的影响。免疫荧光双标检测DRG中P2Y12受体与卫星胶质细胞（SGC）标志物谷氨酰氨合成酶（GS）（SGC的标志物）的共表达。利用蛋白印迹检测姜黄素纳米粒对PKB/AKT及其磷酸化水平的影响。通过姜黄素与P2Y12蛋白分子对接评分,模拟姜黄素与P2Y12受体匹配及相互作用程度。结果:合成的PDAEMA大小均一,形状为球形,包载姜黄素后得到姜黄素纳米粒PDAEMA-CUR在水中分散性好。姜黄素纳米粒对DM大鼠影响的实验如下:第5、7、10周,DM组大鼠的血糖值较Ctrl组显著增加（p<0.001）。第10周,DM+nano curcumin组大鼠血糖值较DM组明显降低（p<0.05）。DM组与DM+nano carrier组相比没有显著差异（p>0.05）。第5周,DM组大鼠体重值较Ctrl组明显增加（p<0.05）。第7周,与Ctrl组相比,DM组大鼠体重值显著下降（p<0.01）。第10周,DM组大鼠体重值较Ctrl组显著下降（p<0.01）。DM+nano carrier组较DM组大鼠体重值相比无显著性差异（p>0.05）。DM大鼠成模后（第6-10周）,DM组大鼠的MWT和TWL较Ctrl组大鼠显著降低（p<0.01）;两次注射姜黄素纳米粒后（第9-10周）,DM+nano curcumin组与DM组相比其MWT和TWL显著升高（p<0.01）。第6-10周,DM组和DM+nano carrier组相比一直无显著性差异（p>0.05）。Q-PCR、蛋白印迹结果表明与Ctrl组大鼠相比DM组大鼠P2Y12的mRNA和蛋白表达水平都升高（p<0.01）;与未处理DM组大鼠相比,经姜黄素纳米粒处理的DM大鼠P2Y12的mRNA和蛋白表达水平显著降低（p<0.01）。免疫荧光双标的结果显示P2Y12受体与SGC标志物谷氨酰氨合成酶（GS）（SGC的标志物）共表达。DM组大鼠DRG中P2Y12受体与GS共表达免疫荧光强度较Ctrl组均明显增加。与未处理DM组相比,DM+nano curcumin组大鼠DRG中P2Y12受体与GS共表达免疫荧光强度显著下降。DM组和DM+nano carrier组之间的P2Y12受体和GS的共表达无明显差异。Q-PCR结果显示DM组较Ctrl组IL-1β、CX43表达明显升高（p<0.01）。姜黄素纳米粒处理的DM大鼠IL-1β、Cx43的mRNA表达水平较DM组大鼠显著降低（p<0.01）。DM组,DM+nano carrier组比较无显著差异（p>0.05）。蛋白印迹结果表明,与Ctrl组相比,DM组大鼠IL-1β、Cx43和磷酸化-AKT（p-AKT）蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。DM+nano curcumin组大鼠IL-1β、Cx43和p-AKT蛋白的表达水平与未处理DM组相比均显著降低（p<0.01）,DM组与DM+nano carrier组比较无显著差异（p>0.05）。大鼠P2Y12受体蛋白和姜黄素的分子对接评分（-7.3,Kcal/mol）表明姜黄素与P2Y12受体存在相互作用。第二部分方法:槲皮素对高脂饮食诱导的肥胖（diet-induced obesity,DIO）模型大鼠的影响实验:将大鼠随机分为正常对照组（Control）、肥胖模型组（DIO）、肥胖模型合并槲皮素组（DIO+Quercetin）、肥胖模型合并DMSO处理组（DIO+DMSO）,对照合并槲皮素组（Ctrl+Quercetin）。检测各组大鼠体重、尾感觉神经传导速度、血清总胆固醇（total cholestrol,TC）、甘油三酯水平、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL）和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL）水平。用实时定量PCR（Q-PCR）、蛋白印迹（Western Blot）检测腹腔注射槲皮素对背根神经节（DRG）P2Y12受体的mRNA和蛋白表达。免疫荧光双标检测DRG中P2Y12受体与卫星胶质细胞（SGC）标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的共表达。利用蛋白印迹检测槲皮素对ERK1/2及其磷酸化水平的影响。通过分子对接方法检测槲皮素与P2Y12蛋白分子对接评分,模拟槲皮素与P2Y12受体的相互作用。槲皮素对高脂（HF）处理SGCs的影响实验:不同浓度高脂（0.25 m M、0.5m M、0.75 m M、1 m M、1.25 m M、1.5 m M）分别作用于原代培养的SGCs分别为24h、48h、72h后筛选出合适的高脂作用浓度与作用时间。培养细胞分组为:正常对照组（Ctrl）、高脂模型组（HF）、高脂模型合并槲皮素处理组（HF+Quercetin）、高脂模型合并DMSO处理组（HF+DMSO）、正常对照合并槲皮素处理组（Ctrl+Quercetin）。检测不同浓度高脂处理细胞时P2Y12 mRNA与蛋白表达水平的变化。用实时定量PCR（Q-PCR）、蛋白印迹（Western Blot）检测槲皮素处理对高脂诱导的SGCs上P2Y12受体的mRNA和蛋白表达变化。利用蛋白印迹检测槲皮素对高脂诱导的SGCs上ERK1/2及其磷酸化水平的影响。用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测槲皮素对高脂处理的细胞上清液中炎性因子IL-1β、TNF-α的变化情况。结果:动物实验显示:肥胖（DIO）模型大鼠体重增加、总胆固醇（total cholestrol,TC）、甘油三酯水、和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL）水平升高,高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL）水平降低。大鼠尾感觉神经传导速度降低。槲皮素改善肥胖模型大鼠异常变化的血脂水平、改善尾感觉神经传导速度。Q-PCR、蛋白印迹结果表明与Ctrl组大鼠相比DIO组大鼠P2Y12的mRNA和蛋白表达水平升高（p<0.01）;与未处理DIO组大鼠相比,经槲皮素处理的DIO大鼠P2Y12的mRNA和蛋白表达水平显著降低（p<0.01）;免疫荧光双标的结果显示P2Y12受体与SGC标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）共表达。DIO组大鼠DRG中P2Y12受体与GFAP共表达免疫荧光强度较Ctrl组均明显增加。与未处理DIO组相比,DIO+Quercetin组大鼠DRG中P2Y12受体与GFAP共表达免疫荧光强度显著下降。DIO组和DIO+DMSO组之间的P2Y12受体和GFAP的共表达无明显差异。蛋白印迹结果表明,DIO+Quercetin组大鼠p-ERK1/2蛋白的表达水平与未处理DIO组相比均显著降低（p<0.01）,DIO组与DIO+DMSO组比较无显著差异（p>0.05）。大鼠P2Y12受体蛋白和槲皮素的分子对接评分（-7.7,Kcal/mol）表明槲皮素与P2Y12受体存在相互作用。培养细胞实验显示:细胞活性检测观察到不同浓度高脂（0.25 m M、0.5 m M、0.75 m M、1 m M、1.25 m M、1.5 m M）对细胞活性的影响,其中0.75 m M、1 m M、1.25 m M、1.5 m M等浓度高脂（HF）对细胞活性有明显损伤作用。0.5 m M HF培养SGCs 24h、48h、72h,细胞存活率分别为85%,78.8%,50.5%与Ctrl组相比显著下降（p<0.01）。根据细胞活性实验结果,选取0.5 m M浓度HF处理48小时建立HF细胞损伤模型。实时定量PCR实验观察到,与Ctrl组相比,0.25 m M HF组中P2Y12 mRNA的表达无明显变化（p>0.05）。0.5 m M HF组、0.75 m M HF,1 m M HF组中P2Y12mRNA表达显着增加（p<0.001）。蛋白印迹结果显示与Ctrl组相比,0.25 m M HF组P2Y12蛋白的表达无明显变化（p>0.05）,0.5 m M HF组、0.75 m M HF组中P2Y12蛋白表达显着增加（p<0.001）。1 m M HF组较Control组P2Y12蛋白表达水平明显下降（p<0.001）。用实时定量PCR、蛋白印迹结果显示,与Ctrl组相比,0.5 m M浓度HF组中P2Y12 mRNA和蛋白表达显着增加（p<0.01）。HF组与HF+DMSO组比较无显著差异（p>0.05）。与HF组相比,HF+Quercetin组中P2Y12 mRNA和蛋白表达显着降低（p<0.01）。蛋白印迹结果显示,与Ctrl组相比,HF组中p-ERK蛋白表达显着增加（p<0.01）。HF+DMSO组和HF组之间p-ERK蛋白表达无明显差异（p>0.05）。与HF组相比,HF+Quercetin组中p-ERK蛋白表达显着降低（p<0.01）。ELISA结果显示:与Control组相比,HF组IL-1β、TNF-α显著升高（p<0.01）。HF+Quercetin组较HF组显著降低（P<0.01）。HF组与HF+DMSO组比较无显著差异（p>0.05）。HF+Quercetin组较HF组显著降低（P<0.01）。结论:成功制备出在水中分散性好,释放缓慢的姜黄素纳米粒。制备的姜黄素纳米粒降低DM大鼠DRG的SGC中上调的P2Y12受体,降低DM大鼠DRG中Cx43和IL-1β表达,降低AKT的磷酸化,抑制DM大鼠DRG的SGC中P2Y12受体介导的痛觉信息传递。因此,姜黄素纳米粒可有效缓解糖尿病模型大鼠的机械和热痛敏反应。槲皮素降低DIO模型大鼠DRG的SGC中上调的P2Y12受体,降低ERK的磷酸化,改善尾感觉神经传导速度。高脂细胞损伤模型中,槲皮素降低DRG的SGCs上P2Y12的表达,并降低细胞上清炎性因子IL-1β、TNF-α。