第一部分DNA双链断裂修复蛋白在乳腺和宫颈良恶性病变组织中的表达研究【目的】研究DNA双链断裂修复蛋白(Ku80、DNA-PKcs和ATM)在乳腺癌和乳腺纤维瘤组织中以及宫颈癌和宫颈上皮内瘤样病变(CIN)中的表达情况,探讨3种蛋白在肿瘤发生发展中的作用及相互关系。【方法】应用免疫组化SP法检测55例乳腺癌和14例乳腺纤维瘤组织,以及41例宫颈癌和15例CIN组织中Ku80,DNA-PKcs和ATM蛋白的表达情况。【结果】Ku80、DNA-PKcs和ATM蛋白在乳腺癌患者中的阳性率分别为74.55%、54.55%和52.73%,在乳腺纤维瘤患者中的阳性率分别为92.86%、92.86%和71.43%;DNA-PKcs蛋白在乳腺癌组织中的表达显著低于乳腺纤维瘤组织(X2=6.98,P=0.01),而Ku80和ATM的表达虽在乳腺癌组织中的表达亦低于乳腺纤维瘤组织,但差异无统计学意义(P>0.05)。ATM和DNA-PKcs蛋白的表达在不同病理类型、肿块大小、临床分期和淋巴结转移状态的乳腺癌患者中差异无统计学意义(P>0.05);但Ku80的表达与患者的肿块大小和临床分期相关(P<0.01)。Spearman等级相关分析,在55例乳腺癌患者中,Ku80与DNA-PKcs的表达呈正相关(r=0.36,P=0.01);Ku80与ATM的表达亦呈正相关(r=0.33,P=0.02)。Ku80、DNA-PKcs和ATM蛋白在宫颈癌患者中的阳性率分别为70.73%、68.29%和19.51%,在CIN患者中的阳性率分别为80.00%、73.33%和33.33%;3种蛋白在宫颈癌组织中的表达均低于CIN组织,但差异无统计学意义(P>0.05)。3种蛋白的表达在不同年龄、病理类型、分化程度和临床分期的宫颈癌患者中差异无统计学意义(P>0.05)。Spearman等级相关分析,在56例患者中,Ku80与DNA-PKcs的表达呈正相关(r=0.58,P=0.00);Ku80与ATM的表达亦呈正相关(r=0.27,P=0.04)。【结论】DNA-PKcs和Ku80有可能成为肿瘤治疗增敏的靶点;DNA-PKcs蛋白可能在乳腺癌的发生发展中起重要作用;Ku80与DNA-PKcs及ATM之间均存在密切关系。第二部分宫颈癌细胞株和正常间质细胞株受X线照射后的辐射效应【目的】利用宫颈癌细胞系和正常血管上皮细胞系、正常成纤维细胞系体外模拟宫颈癌实质和间质血管组织,研究其受到不同剂量放射线照射后的反应。【方法】宫颈腺癌细胞系HeLa,宫颈鳞癌细胞系SiHa、C33A、Caski,及人脐静脉内皮细胞系ECV304、小鼠成纤维细胞系NIH/3T3细胞,分别用6MV的X线(300cGy/min)照射6Gy和10Gy,24h和48h后收集细胞碘化丙锭染色,流式细胞术检测凋亡率和细胞周期变化。【结果】受到照射后C33A凋亡率最高,而SiHa最抵抗,其余细胞系介于两者之间;各宫颈癌细胞系及NIH/3T3照射10Gy后48h产生的凋亡率与6Gy相似(P>0.05),而ECV304照射10Gy后48h产生的凋亡率(13.04%±1.08%)却比6Gy(6.51%±0.61%)高许多(P<0.05);各细胞系受到照射后,均表现出明显的G2/M期阻滞,且G2/M阻滞细胞百分比随照射剂量增加而增加;受到照射后一般在24h~48h G2/M期阻滞细胞百分比最高。【结论】高剂量照射提高肿瘤血管的凋亡率,宫颈癌细胞受照射后G2/M期阻滞,且呈剂量依赖性,为高剂量射线治疗宫颈癌、追加剂量继续放疗、选择周期特异性化疗药物、以及针对G2/M检测点基因进行靶向阻断提供了依据。第三部分DNA双链断裂修复蛋白表达水平与肿瘤细胞放射敏感性的关系研究【目的】检测肿瘤细胞株中DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)修复蛋白(Ku80、DNA-PKcs和ATM)的表达水平和放射敏感性参数,探讨3个蛋白预示肿瘤细胞放射敏感性的价值。【方法】4株人宫颈癌细胞株HeLa、SiHa、C33A和Caski,3株人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453,及1株人肺癌细胞株A549,Western blot检测8株细胞中Ku80、DNA-PKcs和ATM蛋白的表达水平,流式细胞仪检测10Gy 6MV X线照射48h后的凋亡率,克隆形成实验检测SF2(Surviving fraction after 2Gy)值和α、β值,Pearson线性相关分析蛋白表达水平与照射后凋亡率、SF2值和α值的相关性。【结果】3种蛋白在同一株细胞中的表达及同一蛋白在不同细胞株的表达均存在明显差异;DNA-PKcs的表达水平与SF2之间存在正相关关系(r=0.72,P =0.04<0.05);Ku80和ATM的表达与SF2值间无明显相关关系(P>0.05);3种蛋白与凋亡率和α值均无相关性(P >0.05)。【结论】DNA-PKcs蛋白表达越高细胞对放射线越抵抗,其表达水平可能成为肿瘤细胞放射敏感性的指标;DNA-PKcs和Ku80可能可以成为肿瘤放疗增敏的理想靶点。第四部分siRNA抑制Ku80表达后对宫颈癌HeLa细胞放化疗敏感性的影响【目的】建立利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制Ku80表达的HeLa细胞模型,以此探讨Ku80在放化疗增敏方面的潜在应用价值。【方法】构建靶向抑制Ku80的siRNA表达质粒,转染HeLa细胞,筛选稳定表达的转化克隆,Western blot检测Ku80表达变化;克隆形成实验、MTT法和裸鼠皮下瘤形成实验分别检测细胞克隆形成率,及细胞在体外和体内的增殖情况;6MV X线照射6Gy后,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,克隆形成实验检测细胞SF2、D0等值;MTT检测细胞受不同浓度托泊替康、依托泊苷和顺铂作用后细胞增殖率变化。【结果】构建的质粒转染HeLa细胞获得2个稳定转染克隆,Western blot分析表明阳性克隆Ku80蛋白抑制率达到96.4%,命名为HeLa/Ku80-siRNA; HeLa/Neg-siRNA细胞克隆形成率为0.62±0.02,而HeLa/Ku80-siRNA细胞的克隆形成率为0.46±0.05,明显低于对照细胞(t=5.11,P<0.01);MTT显示细胞培养48h和72h时,HeLa/Ku80-siRNA细胞的增殖率均显著低于对照细胞(P<0.05);裸鼠皮下瘤生长实验示种植25天时,HeLa/Ku80-siRNA细胞种植瘤的平均体积(18.92±3.60)mm3,明显低于对照细胞种植瘤体积(194.88±30.61)mm3,(t=12.69,P<0.01),抑瘤率达到90.06%。HeLa/Ku80-siRNA体外受X线照射后48h及72h的凋亡率高于对照细胞(P<0.05),但3株细胞的细胞周期变化无统计学意义(P>0.05);阳性克隆细胞株的D0和SF2值明显降低,在D10剂量时的增敏比为1.365。Ku80受抑细胞对托泊替康和依托泊苷的敏感性增加(P<0.05)。【结论】Ku80-siRNA可以抑制Ku80的表达,在体内外抑制HeLa细胞的增殖,并促进HeLa细胞对X线和拓扑异构酶抑制剂的敏感性。第五部分抑制DNA-PKcs表达促进宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的研究【目的】探讨DSB修复蛋白DNA-PKcs成为宫颈癌放疗增敏靶点的可能性。【方法】利用靶向抑制DNA-PKcs的小发卡样干扰RNA(small hairpin interfering RNA,shRNA)表达质粒和小分子抑制剂LY294002,分别抑制HeLa细胞DNA-PKcs蛋白表达和活性后,克隆形成实验和流式细胞仪检测HeLa细胞受6MV X线照射后的SF2、α值和凋亡率变化。【结果】靶向抑制DNA-PKcs的shRNA可以促进宫颈癌HeLa细胞的放射敏感性,其SF2值为0.37,显著低于对照HeLa细胞的0.53;单独接受50μmol/L LY294002作用1h未使HeLa细胞的凋亡率明显增加(P>0.05),但先经LY294002处理再照射6Gy的HeLa细胞在48h和72h的凋亡率比单独照射6Gy的HeLa细胞凋亡率显著增加(48h点:t=3.25,P=0.03;72h点:t=3.01,P=0.04)。【结论】抑制DNA-PKcs的表达或活性可以促进宫颈癌HeLa细胞的放射敏感性;提示DNA-PKcs可能可以成为宫颈癌放疗增敏的理想靶点。第六部分协同抑制Ku80和DNA-PKcs对HeLa细胞放射生物学功能的影响【目的】研究siRNA和LY29400抑制单个或多个DNA双链断裂修复蛋白后HeLa细胞放射敏感性和细胞周期的变化。【方法】Ku80受抑细胞HeLa/Ku80-siRNA和对照细胞HeLa/Neg-siRNA分别转染可以靶向抑制抑制DNA-PKcs的siRNA或用PI-3-K抑制剂LY294002处理,经6MV X线照射后,克隆形成实验检测细胞放射敏感性变化,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率变化。【结果】转染DNA-PKcs-siRNA后的HeLa/Ku80-siRNA放射敏感性显著高于HeLa/Ku80-siRNA , SF2分别为0.08±0.01和0.20±0.05 , LY294002作用后HeLa/Ku80-siRNA的SF2达到0.03±0.01,作为对照细胞的HeLa/Neg-siRNA其SF2值为0.51±0.07;各细胞照射6Gy后均出现G2/M期阻滞,转染DNA-PKcs-siRNA的HeLa/Neg-siRNA细胞和LY294002作用的HeLa/Ku80-siRNA、HeLa/Neg-siRNA细胞G2/M期阻滞逐渐缓慢出现,照射后72h仍未达到顶点,而其他细胞G2/M期阻滞均于照射后48h达到顶点。【结论】在抑制Ku80已达95%的基础上,DSB修复功能可以由其他DSB修复蛋白如DNA-PKcs和ATM代偿,协同抑制上述蛋白可以明显增加HeLa细胞的辐射敏感性;Ku80、DNA-PKcs和ATM在细胞的G2/M期阻滞过程中发挥的作用不同。