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目的:应用基因芯片技术分析出与MM病人生存率和耐药相关的基因,选择一个重要候选癌基因RFWD2;从体内外探讨RFWD2基因表达与MM细胞增殖及耐药的关系;探究RFWD2引起MM耐药的机制;寻找一种可以抑制MM细胞增殖的中药。方法:1、首先采集了初诊和大剂量化疗后的MM患者骨髓样本,使用Afffymetrix U133 Plus 2.0基因芯片分析,得到全基因组表达谱,选择一个候选癌基因,分析该基因表达与MM病人生存率和耐药的关系;使用靶向RFWD2的cDNA或shRNA病毒液感染MM细胞系ARP1和H929细胞,并筛选出稳定表达的细胞株,通过蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)验证稳转细胞中RFWD2表达情况,采用MTT比色法检测转染细胞与对照组细胞增殖情况;通过WB检测耐药MM细胞株与敏感型MM细胞株中RFWD2表达情况。2、采用MTT法检测阿霉素(Adriamycin,ADR)、地塞米松(Dexamethasone,DXM)、硼替佐米(Bortezomib,BTZ)、卡非佐米(Carfilzomib,CFZ)和伊沙佐米(Ixazomib,IXZ)5种MM化疗药对正常和高表达RFWD2的ARPA、H929细胞的毒性,计算药物IC50值;采用流式细胞术检测以上5种化疗药引起的正常和高表达RFWD2的ARP1、H929细胞凋亡情况。3、给NOD/SCID免疫缺陷小鼠注射正常或高表达RFWD2的ARPI细胞,建立骨髓瘤异种移植瘤小鼠模型,给药组分别注射ADR或BTZ,使用卡尺定期测量肿瘤直径,至肿瘤直径达到20mm时处死小鼠,肿瘤被剥离,拍照,称重,冷冻保存。4、通过体内泛素化实验验证RFWD2表达对P27泛素化修饰的影响,通过WB验证RFWD2表达与P27的3个E3泛素连接酶Artemis、KPC2和RCHY1表达之间的关系,筛选出和RFWD2表达有关的E3,通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验验证细胞内RFWD2蛋白与筛选出的E3连接酶蛋白之间是否具有相互作用。5、采用MTT法检测枇杷叶三萜酸对MM细胞增殖的体外抑制作用;通过建立骨髓瘤异种移植瘤小鼠模型并给予枇杷叶三萜酸干预,使用卡尺定期测量肿瘤直径,至肿瘤直径达到20mm时处死小鼠,肿瘤被剥离,拍照,称重,冷冻保存。结果:1、基因测序结果表明,在初诊的MM病人中,RFWD2基因表达显著高于在意义未明单克隆球蛋白血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS)和正常血浆(normal plasma,NP)中表达(P<0.0001);Kaplan-Meier生存分析发现,在接受Total Therapy 2(TT2)治疗的病人中,高表达RFWD2的病人的总生存期(overall survival,OS)和无事件生存期(event-free survival,EFS)显著低于低表达的病人;在Assessment of Proteasome Inhibition for Extending Remission(APEX)临床试验的结果中,高表达RFWD2的病人的OS显著低于低表达的病人。经WB验证表明RFWD2 shRNA和RFWD2 cDNA转染MM细胞模型构建成功。MTT检测细胞增殖情况的结果显示,和对照组细胞相比,RFWD2下调的MM细胞生长受到明显抑制,高表达RFWD2则促进MM细胞生长。同时,WB结果发现RFWD2表达与P27表达水平呈负相关。基因测序结果显示,复发的MM病人RFWD2水平显著高于基线水平(P<0.0001);在TT2试验复发病人的OS分析中,高表达RFWD2基因的病人生存率显著低于低表达的病人;对硼替佐米耐受的病人RFWD2基因信号水平显著高于对硼替佐米敏感的病人;而RFWD2基因水平在对地塞米松耐受和敏感的病人之间无显著性差异。WB结果显示,和正常MM.1细胞相比,地塞米松耐药的MM.1中RFWD2表达反而更低,P27表达无差异;和正常的8226或ANBL6细胞相比,硼替佐米耐药的8226或ANBL6细胞中RFWD2表达明显升高,P27表达则相反。2、MTT结果显示,在正常和高表达RFWD2的细胞之间阿霉素和地塞米松药物的IC50值没有明显差异;而硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米这三种蛋白酶体抑制剂对高表达RFWD2的细胞IC50值明显高于正常对照组细胞。通过流式细胞术分析的细胞凋亡情况和MTT结果一致,在正常和高表达RFWD2的细胞之间阿霉素和地塞米松引起的凋亡没有显著差异;而在硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米刺激下,高表达RFWD2的细胞凋亡率低于正常对照组细胞。3、动物实验结果显示,高表达RFWD2的小鼠形成的肿瘤重量和体积高于对照组的;硼替佐米治疗后,高表达RFWD2的小鼠形成的肿瘤重量和体积同样高于对照组的;然而,地塞米松治疗后,高表达RFWD2的小鼠形成的肿瘤重量与对照组无明显差异,肿瘤体积却小于对照组。4、体内泛素化实验结果显示,高表达RFWD2的细胞中P27的泛素化水平高于对照组。WB结果显示,和对照细胞相比,高表达RFWD2的细胞中,只有RCHY1的表达同样升高,另两个P27的泛素连接酶的表达没有差异;RFWD2下调的细胞中,RCHY1的表达也同样降低。Co-IP结果显示,RFWD2与RCHY1之间有相互作用。Kaplan-Meier生存分析显示,TT2和APEX病人中,共同高表达RFWD2和RCHY1的病人生存率明显低于中等表达和低表达两种基因的病人。5、MTT结果显示,枇杷叶三萜酸不仅可以抑制MM野生型细胞生长,而且可以抑制RFWD2高表达的MM细胞生长。动物实验结果显示,枇杷叶三萜酸可以抑制肿瘤的生长,但是和对照组相比不具有统计学意义。结论:RFWD2高表达与MM患者复发耐药相关。在体外,高表达RFWD2引起MM细胞对蛋白酶体抑制剂类耐药。在体内,高表达RFWD2引起MM小鼠对硼替佐米耐药。RFWD2通过和RCHY1泛素连接酶相互作用来调节P27的泛素化。枇杷叶三萜酸可以抑制MM细胞增殖。