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背景与目的2020年全球癌症统计数据表明,目前中国最常见的癌症类型和引起癌症死亡的主要瘤种仍是肺癌。随着医学生物学发展,陆续有研究表明DNA甲基化等表观遗传学改变及基因拷贝数变异（Copy number variation,CNV）等遗传变异均可能参与了肿瘤的发生发展过程。多项研究提示卵巢肿瘤泛素异肽酶1（OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein B1.OTUB1）参与了胃腺癌、结直肠癌及卵巢癌等肿瘤的发生发展且其高表达状态与患者的不良预后相关。目前OTUB1在非小细胞肺癌（Non-small-cell lung carcinoma,NSCLC）中的表达及临床意义、OTUB1基因CNV及甲基化情况、OTUB1相关分子功能及生物过程等方面的研究均有限。随着精准医学的发展肺癌的治疗方式不断更新,其中就包括了 PD1程序性死亡受体（Programmed death receptor,PD1）/程序性死亡配体（Programmed cell death ligand 1,PD-L1）单抗为代表的免疫治疗。免疫治疗的使用使得部分肺癌患者获得了较好的临床疗效,但是多数患者的客观缓解率仍旧较低且随之而来的还有免疫治疗耐药问题,故针对改善免疫治疗疗效的探索成为了当下的研究热点。研究表明乳腺癌细胞中对OTUB1的敲低明显下调了 PD-L1蛋白量,而在NSCLC中OTUB1是否影响PD-L1蛋白表达尚未可知。本研究通过生物信息学分析结合免疫组织化学染色法探索在NSCLC中OTUB1的表达情况及临床意义,OTUB1基因的CNV、甲基化情况,其涉及的信号通路及生物过程,分析OTUB1与PD-L1的表达相关性。材料与方法1生物信息学分析于TIMER中检索各瘤种的癌组织及正常组织OTUB1 mRNA表达情况。分析TCGA中NSCLC与正常组织间OTUB1 mRNA表达差异。GSCA利用TCGA数据库中数据,分析NSCLC中OTUB1 CNV情况、NSCLC组织与正常组织间OTUB1甲基化情况、OTUB1 CNV及甲基化与其mRNA表达间的相关性。利用GSEA进行OTUB1的KEGG富集,预测其可能参与的信号通路,并对OTUB1进行GO功能显著性富集,分析其可能的分子功能及生物过程。2免疫组织化学染色收集本院60例NSCLC患者术后癌组织蜡块及41例癌旁正常组织蜡块。采用免疫组织化学染色进行检测蛋白表达情况。3统计分析方法癌组织与正常组织间OTUB1 mRNA表达差异采用Wilcoxon.test分析,NSCLC组织较正常组织中OTUB1甲基化差异采用t检验分析。变量间的相关性分析采用Spearman等级相关分析。KEGG富集结果中满足NOM P-val≤0.05且FDR q-val≤0.05的通路定义为显著富集通路。GO富集分析中满足FDR q-val≤0.05的定义为显著富集的GO功能条目。余应用SPSS 22.0.0软件对计数资料间采用χ2检验比较,计数资料以频数/率表示。采用GraphPad Prism 8.0进行RFS曲线图绘制,并采用log-rank检验进行组间RFS率差异的比较,采用Cox风险比例模型回归对RFS影响因素进行分析。检验水准α=0.05。结果1 0TUB1相关生物信息学分析1.1多瘤种的癌组织与正常组织间OTUB1 mRNA表达差异有统计学意义,其中包括肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）及肺鳞癌（Lung squamous cell carcinoma,LUSC）、膀胱癌及乳腺癌等。1.2 LUAD 组织（P=9.179e-14）与正常组织,LUSC 组织（P=1.498e-24）与正常组织间OTUB1 mRNA的表达差异均有统计学意义。1.3 LUAD中OTUB1 CNV占比达到42.25%,其类型包括了杂合性扩增（25.78%）,纯合性扩增（0.58%）及杂合性缺失（15.89%）。LUSC中OTUB1 CNV占比达到43.31%,其类型包括了杂合性扩增（23.35%）,纯合性扩增（0.20%）及杂合性缺失（19.76%）。1.4 在 LUAD（r=0.49,FDR q-value=7.72e-31）及 LUSC（r=0.57,FDR q-value=3.52e-44）中OTUB1 CNV与OTUB1 mRNA表达之间均呈现正相关性。1.5 LUAD（FDR q-value=1.07e-3）及 LUSC（FDR q-value=8.03e-3）较正常组织OTUB1甲基化均呈现下降改变。1.6 在 LUAD（r=-0.19,FDR q-value=5.03e-5）及 LUSC（r=-0.33,FDR q-value=9.78e-11）中OTUB1甲基化与OTUB1 mRNA间均呈负相关。1.7 KEGG富集提示LUAD中OTUB1高表达组主要富集于嘧啶嘌呤代谢通路、蛋白酶体通路、碱基切除修复及核苷酸切除修复通路。LUSC中OTUB1高表达组富集于碱基切除修复、错配修复及核苷酸切除修复通路,泛素介导的蛋白水解过程。1.8 GO富集提示OTUB1涉及双链断裂修复的负调控,K48连接蛋白的去泛素化,适应性免疫反应,蛋白质去泛素化,DNA修复等多种生物过程。此外,OTUB1富集于巯基依赖性泛素特异性蛋白酶活性,巯基依赖性泛素水解酶活性,泛素结合及结合泛素蛋白连接酶等分子功能。2免疫组化检测OTUB1蛋白表达、分析OTUB1蛋白的临床意义及与PD-L1的表达相关性2.1 60例NSCLC患者癌组织中OTUB1呈阳性表达的为34例（56.7%）,41例NSCLC患者癌旁正常组织中OTUB1呈阳性表达的为15例（36.6%）,其间OTUB1表达差异有统计学意义（χ2=3.932,P=0.047）。2.2 OTUB1蛋白表达与T分期（P=0.006）及TNM分期（P=0.025）存在相关性。T3～T4期患者组织中OTUB1的阳性表达率高于T1～T2期患者;Ⅲ期患者组织中OTUB1的阳性表达率高于Ⅰ+Ⅱ期患者,而OTUB1表达与性别、年龄、吸烟史、分化程度、N分期及病理类型均无统计学相关性。2.3 Cox 分析提示 TNM 分期晚（Ⅲ期 vs.Ⅰ+11 期）（HR=4.872,P＜0.001）及分化程度差（中低分化vs.高分化）（HR=2.950,P=0.008）的患者RFS更差。而不同OTUB1表达水平间患者RFS率差异无统计学意义（P=0.330）。2.4 OTUB1蛋白表达与PD-L1蛋白表达间具有统计学相关性（P=0.021）。结论（1）生物信息学提示在包括LUAD及LUSC在内的多瘤种中OTUB1 mRNA表达均高于正常组织,且在LUAD及LUSC中OTUB1 CNV及OTUB1甲基化均与OTUB1 mRNA表达具有相关性。（2）LUAD及LUSC中OTUB1蛋白表达高于癌旁正常组织,且OTUB1的蛋白表达与肿瘤T分期及不同的TNM分期相关。（3）PD-L1蛋白表达与OTUB1蛋白表达可能相关。