研究背景和目的:骨是肿瘤转移的好发部位,除肝肺外,占肿瘤转移部位的第三位。超过70%的前列腺癌和乳腺癌及超过15%～30%的肺癌及其他实体性肿瘤发生骨转移,而前列腺癌和乳腺癌占男女发病率第一位,肺癌则占男女发病共同第二位。肿瘤一旦发生骨转移其5年生存率显著减低,且肿瘤发生骨转移将几乎不可能治愈及带来严重的并发症,包括顽固性骨痛、病理性骨折、威胁生命的高钙血症、脊髓受压综合征等,严重影响患者的生活质量和生存期。因此如何预防及治疗肿瘤骨转移的意义重大。肿瘤骨转移是一个“恶性循环”的过程,肿瘤-骨微环境中的一系列细胞因子和生长参与“恶性循环”的过程,调节细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用,介导肿瘤的生长和骨质破坏。骨质破坏可以分为溶骨性骨破坏和成骨性骨破坏,不论那一类型的骨破坏,破骨细胞(osteoclasts,OCs)是骨破坏的关键,肿瘤细胞及其他细胞通过促进破骨细胞的生成和活化而介导骨破坏。因此OCs是我们研究和治疗肿瘤骨破坏的关键靶点。CD147又名细胞外金属基质蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloprotease inducer,EMMPRIN),其高表达于多种肿瘤外周,与肿瘤的生长、浸润、转移和预后相关;CD147参与肿瘤的生物学行为过程与CD147介导MMPs的产生,诱导血管生成及参与肿瘤细胞的粘附、迁移、对缺氧的耐受和多重耐药有关。研究发现抑制CD147在肿瘤中的表达可以抑制肿瘤微环境中MMPs的表达,抑制肿瘤的浸润和转移,减轻肿瘤负荷及增加肿瘤放化疗治疗的敏感性,因此CD147是肿瘤转移治疗的关键因子。CD147还被发现参与体内的炎性过程,在类风湿性关节炎的研究中发现,CD147表达于类风湿关节炎的单核/巨噬细胞中,通过调节MMPs的分泌,参与关节软骨、骨组织的破坏;在牙周炎的研究中发现CD147参与牙槽骨的破坏过程。最新的研究发现抑制CD147的表达能减轻乳腺癌的骨转移及骨破坏。因此CD147可能直接和间接的参与肿瘤骨转移及骨破坏过程。在骨巨细胞瘤的研究中发现,CD147与骨巨细胞瘤分级及预后相关,且在体外培养破骨样细胞的过程CD147表达增高。因此我们推测CD147参与OCs的分化成熟过程及参与OCs的活化。本研究通过体外建立外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells ,PBMCs)向OCs分化成熟的模型,研究CD147对体外破骨细胞分化成熟及活性的影响,探讨CD147参与OCs分化成熟及活性调节的方式,完善CD147对肿瘤骨破坏过程的认识,为CD147作为新的抗肿瘤转移骨破坏治疗靶点提供新的认识和理论依据。方法:1.Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs,贴壁法纯化PBMCs;2.RANKL+M-CSF诱导PBMCs向OCs分化,TRAP染色和骨吸收实验鉴定诱导生成的细胞;3.实验分别分为三组(对照组、诱导组和阻断组)和两组[对照组(正常诱导组)和蛋白组];4.间接免疫荧光染色检测CD147分子在对照组、诱导组、阻断组PBMCs上的表达;5.流式细胞术检测对照组、诱导组、阻断组24、48 h PBMCs胞膜上CD147分子的表达量;6.分别于第3、6、9、12、15 d对培养的细胞进行形态观察并TRAP染色,对随机选取4个视野中的TRAP(+)细胞进行计数;7.细胞在骨片上培养30 d后,甲苯胺蓝染色,观察骨吸收陷窝情况,对随机选取6个视野中的骨吸收陷窝进行计数;8.Real-time PCR检测PBMCs 24、48 h的CD147、TRAP mRNA的表达,及分析两者的相关性。9.采用SPSS16.0统计学软件进行数据分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.Ficoll法分离外周血单个核细胞分层明显,获得满意数量的细胞,延长贴壁时间纯化单个核细胞获得满意数量的单个核细胞,满足下一步实验要求;2.RANKL+M-CSF诱导PMBCs生成TRAP(+)单核和多核的细胞,并形成骨吸收陷窝;3.间接法免疫荧光染色显示空白对照组无绿色荧光表达,阴性对照组OPCs膜上有弱的荧光表达,而对照组、诱导组、阻断组的OPCs细胞呈串珠样排列,细胞膜上均有较强的FITC绿色荧光表达;4.流式结果显示对照组、诱导24 h组、诱导48 h组的荧光表达强度逐渐增强(P<0.05),阻断24 h组荧光强度相对于对照组显著减弱,阻断48 h组荧光强度相对于阻断24 h组反而增高但低于诱导48 h组(P<0.05);5.TRAP染色结果示:阻断组各天TRAP(+)细胞数显著少于诱导组(P<0.01),且生成的破骨细胞体积小;蛋白组TRAP(+)细胞数在第6、9、12 d显著多于同时间正常组、第15 d TRAP(+)细胞数显著少于同组第12 d及对照组第15 d,且蛋白组TRAP(+)细胞数峰值显著高于对照组(P<0.01);6.骨吸收实验结果示:阻断组陷窝个数显著少于诱导组(P<0.05),且形成的陷窝面积较小;蛋白组形成成片的骨吸收陷窝,形成的骨吸收陷窝个数显著多于对照组(P<0.01);7.Real-time PCR结果显示:48 h时相点CD147、TRAP mRNA的表达量在阻断组和诱导组均高于24 h时相点表达量(P<0.05);阻断组CD147 mRNA的表达量在24、48 h时相点均低于诱导组,且阻断组TRAP mRNA相对表达量也显著低于诱导组(P<0.05);蛋白组细胞24、48 h CD147及TRAP mRNA均显著高于对照组(P<0.05);两次实验TRAP mRNA的相对表达量与CD147 mRNA的表达量均呈显著正相关(R=0.833和0.814,P<0.01);结论:1.使用RANKL+M-CSF刺激外周血单个核细胞向破骨细胞分化,诱导生成的细胞TRAP染色阳性且具有骨吸收能力,此模型能成功诱导破骨细胞的生成;通过延长单个核细胞贴壁时间可以获得满意数量的破骨细胞,满足下一步的实验要求。2.CD147在破骨前体细胞上存在表达,且随着诱导时间的增加,其在破骨前体细胞上表达增强;破骨前体细胞TRAP mRNA的表达与CD147 mRNA水平正相关。3.CD147mAb能抑制破骨前体细胞CD147基因和蛋白水平的表达,且抑制破骨细胞的生成(延迟成熟和减少成熟细胞数量)和减弱其骨吸收能力。4.外源性CD147蛋白增强破骨前体细胞CD147 mRNA的表达,且促进破骨细胞的生成(缩短成熟时间和增加成熟细胞的数量)和增强其骨吸收能力。5.CD147参与破骨细胞分化成熟的过程及调节破骨细胞的活性,是破骨细胞生成和功能发挥的重要调节因子,可以作为抗破骨细胞生成及活性的治疗靶点。