体细胞诱导为多能干细胞是一种获取多能干细胞的新方法,即采用特异性转录因子,将体细胞重编程为具有干细胞特性的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs),为胚胎干细胞建系困难的家畜提供一种获得多能干细胞的新途径。水牛是我国南方的主要家畜,除了为人类提供肉食和役用之外,其水牛奶营养丰富,是优质的奶源之一。但是,水牛的产奶量低,其各方面的生产性能需要改进。采用干细胞介导的转基因克隆技术可以实现定点打靶转基因操作,是提高水牛生产性能的先进遗传改良技术之一。但是,关于水牛干细胞多能性相关的信号路径和培养条件等研究甚少,水牛胚胎干细胞的建系困难,要应用于基因打靶技术还存在诸多困难。因此,对水牛iPSCs这种新型多能干细胞的研究显得尤为重要。本研究首次采用逆转录病毒载体携带水牛特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28,对水牛成纤维细胞(BFFs)重编程为水牛诱导多能干细胞(biPSCs)的方法和机理、biPSCs的生物学特性和表观遗传修饰等进行系统的探讨,以期为研究水牛干细胞信号通路和水牛遗传改良奠定基础。同时,本研究也利用iPSCs相关转录因子在物种间的高度保守性,使用水牛源的转录因子,对兔成纤维细胞(RFFs)重编程为兔诱导多能干细胞(RiPSCs)的方法和生物学特性等进行探索,为iPSCs应用于人类再生医学提供动物模型,同时也为兔遗传改良提供的手段之一。1、克隆和分析了水牛iPSCs相关的六个转录因子。参考GenBank中已公布的各个物种Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、 Nanog和Lin28(简称OSKMNL)的序列,设计、合成特异性引物。采用RT-PCR的方法,从水牛胎儿生殖嵴和小肠组织获取水牛OSKMNL的编码序列(CDS)。SV40large T antigen (T)的编码序列采用同样方法从293T细胞获取。测序结果表明,OSKMNLT的基因CDS的长度分别为1083bp、966bp、1434bp、1320bp、903bp、618bp和2130bp。同源性分析表明,水牛OSKMNL氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应序列具有高度的保守性,同源性分别为：Oct4(98%、96%、91%和81%),Sox2(96%、95%94%和94%),Klf4(99%、97%、92%和92%),c-Myc(98%、96%、91%和86%),Nanog (90%、81%、69%和47%),Lin28(98%、97%、89%和91%)。同时,采用PCR从水牛基因组中分段扩取Oct4和Nanog的基因组全长DNA序列。测序后拼接结果表明,水牛Oct4全长4508bp,包括5个外显子和4个内含子；Nanog全长4473bp,包括4个外显子和3个内含子。2、构建了不同的逆转录病毒载体和摸索出适合于生产水牛iPSCs的病毒系统。采用pMSCV和pMX逆转录病毒载体携带绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,探索出能高效感染BFFs,用于生产水牛iPSCs的逆转录病毒系统和操作体系；同时,构建携带水牛特异性转录因子的逆转录病毒载体,建立生产iPSCs的小鼠模型,为水牛iPSCs的生产提供实验平台。结果表明,pMX介导的逆转录病毒系统所生产的假病毒感染BFFs的效率高于pMSCV逆转录病毒系统,pMX逆转录病毒系统更适合用于生产水牛iPSCs;超速离心后的重组假病毒,可以提高感染BFFs的效率；pMX病毒载体介导水牛转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc可以将小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs,碱性磷酸酶染色呈阳性,成功建立iPSCs小鼠模型；构建用于生产水牛iPSCs的逆转录病毒载体有pMSCV-EGFP, pMX-EGFP, pMX-Oct4-IRES-GFP, pMX-Oct4, pMX-Sox2, pMX-Klf4, pMX-c-Myc, pMX-Nanog, pMX-Lin28, pMX-LT, pMX-LT-IRES-GFP, pMX-hTERT-IRES-GFP (LT为SV40large T antigen, hTERT为人端粒酶逆转录酶,简称“hT”)。3、优化了水牛iPSCs诱导体系,并探索抑制p53表达来提高水牛iPSCs诱导效率。根据生产iPSCs常用的转录因子组合,探索出生产水牛iPSCs的转录因子组合。同时,在最佳组合条件下,探索SV40large T antigen和p53抑制剂等提高重编程效率的可行性。将AP染色着色较深的iPSCs克隆视为统计对象的阳性克隆。结果显示,OSKM组合得到21个AP阳性克隆, OSNL没有得到阳性克隆,而OSKMNL组合可以将AP阳性克隆数提高到38个；OSKM或OSKMNL结合大T抗原和人端粒酶逆转录酶hTERT可以显著提高AP阳性克隆数,特别是OSKM结合大T抗原可以获得77个AP阳性克隆；虽然BFFs表达Klf4和c-Myc,但是去除Klf4或c-Myc的组合没有克隆产生。经OSKM感染后的BFFs,采用c-Myc,抑制剂pifithrin-α (PFT-α)处理8d,可以将AP阳性克隆数提高到67个。水牛iPSCs体外扩增发现,OSKMT组合获取的水牛iPSCs可以传至10代以上,仍能保持不分化状态和正常的核型,而其它组合只能传至4-6代。TaqMan定量PCR (QPCR)检测发现,p53在水牛iPSCs和“EG-样细胞”中的表达量显著低于在BFFs的表达量；采用大T抗原或PFT-α结合OSKM诱导第6d,发现p53在OSKMT和OSKM+PFT两组的表达量显著低于在同一时期OSKM中的表达量。因此,OSKM组合能将水牛的体细胞重编程为多能干细胞；SV40large T antigen和PFT-α可以通过降低p53的表达从而提高生产水牛iPSCs的效率。4、初步鉴定了水牛iPSCs的生物学特性和重编程中多能基因启动子的甲基化状态。水牛iPSCs的生物学特性研究结果表明,biPSCs具有干细胞的特有属性,并能作为供体细胞生产克隆囊胚。水牛iPSCs克隆的形态与人和猪iPSCs的克隆相似,表达AP、Oct4、Sox2、Nancg、SSEA-1、 SSEA-4、TRA-1-81和E-Cadherin等标志基因；RT-PCR结果表明biPSCs表达干细胞相关基因：Oct4、Sox2、Nancg、Klf4、c-Myc、FOXD3、STAT3、GP130、bFGF2、E-Cadherin和p53等,这些基因也在水牛内细胞团(ICM)和“EG-样细胞”内表达。Taqman荧光定量PCR研究发现,Oct4、Sox2和Nanog在biPSCs完全被激活,并与ICM和“EG-样细胞”的表达模式相当。外源标记基因GFP荧光检测发现,外源转基因在第4代至第6代的biPSCs中开始沉默；进一步RT-PCR检测表明,外源基因在传至10代的biPS1和biPS2中完全沉默,而在其它克隆中仍有表达(如iPS3等)。对Oct4、Nanog、Sox2和E-Cadherin启动子区甲基化状态分析表明,在BFFs中Oct4和Nanog处于高甲基化状态；在pre-biPSCs (’‘不完全重编程”的biPSCs)中Oct4处于高甲基化状态；在完全重编程的biPSCs中,Oct4和Nanog处于低甲基化状态；而Sox2和E-cadherin在BFFs、 pre-biPSCs和biPSCs一直处于低甲基化状态。体外和体内分化实验结果表明,biPSCs可以在体外分化实验中形成拟胚体(EB),并表达三个胚层的标志基因AFP,GATA4(内胚层,endoderm), ACTA2(中胚层,mesoderm)和TUBB3(外胚层,ectoderm);将biPSCs注入裸鼠体内,可以形成包含三个胚层各种组织的畸胎瘤,如外胚层的表皮和神经组织(epidermis, neural tissues),中胚层的肌肉和软骨组织(muscle, cartilage)及内胚层的消化道和呼吸道上皮(gut-like epithelium, respiratory epithelium);进一步PCR检测发现,这些畸胎瘤来源于biPS1和biPS2,并非裸鼠本身自发形成。同时,将biPSCs作为核供体细胞应用于水牛克隆胚胎生产,结果发现,biPSCs来源的重构胚能发育到囊胚阶段。5、水牛特异性转录因子将兔成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞。根据iPSCs相关转录因子在物种间高度保守的特性,利用水牛转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc (OSKM)及SV40large T antigen(LT)探索兔胎儿成纤维细胞(RFFs)重编程为兔诱导多能干细胞(RiPSCs)。结果表明,水牛源OSKM结合LT可以将RFFs直接重编程为RiPSCs。对RiPSCs的生物学特性鉴定发现,RiPSCs的克隆形态与人类iPSCs和ES细胞类似,具有典型的干细胞形态特征,在含有bFGF和LIF的干细胞培养基中可以传至15代,且核型正常；RiPSCs呈碱性磷酸酶阳性,表达UTF-1、Oct4、Nancg、SSEA-1、 SSEA-4、Tra-1-81、c-Myc和Klf4等标志基因。外源基因表达检测结果表明,外源基因GFP在传至7代左右的RiPSCs中沉默；进一步RT-PCR结果显示,所有外源基因在RiPS1、RiPS3和RiPS6中完全沉默,而在其它克隆中沉默不完全,如Klf4和LT在RiPS7中仍有表达。对Nanog启动子区CpG岛甲基化状态分析结果表明,Nanog启动子区在RFFs中处于高甲基化状态,在传至15代之后的RiPSCs中则处于低甲基化状态。Nanog在重编程中去甲基化趋势与Nanog在RiPSCs中表达是一致的。体外和体内分化实验表明,RiPSCs在体外悬浮培养可以形成含有三个胚层在内的拟胚体(EBs),表达三个胚层的标志基因AFP(内胚层,endoderm), Desmi、BMP4(中胚层,mesoderm)和ⅠPAX6、MAP2(外胚层,ectoderm); RiPSCs注入裸鼠体内,可以形成包括三个胚层在内的畸胎瘤,如外胚层的表皮组织(epidermis),中胚层的软骨组织(cartilage)和内胚层的消化道上皮组织(gut-like epithelium)。这些结果表明,水牛特异性转录因子OSKM可以将RFFs完全重编程为具有干细胞特有生物学特性的RiPSCs,同时具有多能性和分化潜能。