肌原纤维形成调节因子1(Myofibrillogenesis regulator 1,MR-1)是一种新发现的人类功能基因,以往研究表明MR-1与心肌细胞重构、收缩及信号转导等过程相关,该基因在心肌肥大细胞和白血病细胞中高表达。阐明该基因在肿瘤发生以及细胞信号转导通路中的作用及其机理,将有助于肿瘤的诊断与防治。本研究主要目的是探索MR-1基因在肿瘤细胞增殖、粘附和迁移过程中的作用及机制,阐明MR-1作为一个肿瘤治疗的新靶点的可行性。研究结果如下:1.MR-1在肿瘤细胞中的表达与定位对人正常细胞以及不同肿瘤细胞中MR-1 mRNA以及蛋白进行检测,结果表明,在人肿瘤细胞中MR-1的表达高于正常细胞,提示MR-1有可能为肿瘤相关基因。其中人肝癌细胞HepG2表达水平最高。我们构建了MR-1和绿色荧光蛋白融合表达的载体,并将它转染HepG2细胞,结果发现MR-1和绿色荧光融合蛋白主要表达于细胞质中。2.MR-1表达下调引起的细胞生物学行为改变RNA干扰技术主要通过外源导入与靶基因mRNA互补的双链RNA,从而抑制靶基因的蛋白表达。本研究选取MR-1表达水平最高的HepG2细胞,通过化学合成的21个核苷酸的短干扰核糖核酸(siRNA)干扰降低HepG2细胞中MR-1的表达水平,观察细胞生物学行为发生的变化。根据siRNA设计原理,设计并合成了2个siRNA干扰序列。转染细胞36小时后检测细胞内MR-1蛋白的表达水平,选择抑制效果最好的序列,进行后续工作的研究。生长曲线法以及克隆形成实验检测MR-1-siRNA对HepG2细胞增殖速率的影响。结果显示,经MR-1-siRNA处理后,HepG2细胞生长速度明显减慢,克隆形成率抑制率为66.81%。Transwell实验检测MR-1-siRNA对HepG2细胞迁移能力的影响。结果显示,经siRNA处理后,细胞3小时内穿过8μm滤膜的细胞数明显减少,为对照组细胞数的37.27%。细胞基质粘附试验检测MR-1-siRNA对细胞与基质之间粘附能力的影响。结果显示,经MR-1-siRNA处理后,细胞对纤维粘连蛋白(FN)的粘附能力下降。结果说明MR-1可促进肿瘤细胞的生长,运动以及粘附。3.HepG2/MR-1(-)细胞的生物学行为改变我们构建了可以稳定表达MR-1-shRNA的pCD-sh-MR-1载体,并将它稳定转染HepG2细胞,进行单克隆培养后,建立MR-1稳定沉默的HepG2/MR-1(-)细胞系。作为对照,建立了HepG2/mock细胞系。对HepG2/MR-1(-)细胞系的生物学行为进行检测,结果显示其体外增殖速率显著降低,克隆形成率抑制率为31.77%;细胞迁移能力明显下降,抑制率为56.55%;HepG2/MR-1(-)细胞对FN的粘附能力在15～90min培养时间点与HepG2细胞比较明显下降;另外,HepG2/MR-1(-)细胞在FN上的伸展形态发生改变,伸展速度下降。体内成瘤性试验表明,HepG2/MR-1(-)细胞裸鼠皮下移植瘤生长速率与HepG2细胞相比明显降低,抑制率达91.01%。4.BEL-7402/MR-1(+)细胞的生物学行为改变采用能在真核细胞中高效表达目的基因的质粒pcDNA3.1+,我们构建了MR-1高表达质粒pcDNA3.1-MR-1。将pcDNA3.1-MR-1稳定转染入BEL-7402细胞中,经过单克隆挑选,建立BEL-7402/MR-1(+)细胞系,Western blot法检测,证明该细胞系中MR-1蛋白的表达水平显著增加。同时稳定转染pcDNA3.1+,建立BEL-7402/EV细胞系。生长曲线以及克隆形成实验检测BEL-7402/MR-1(+)细胞系的增殖速率,结果显示BEL-7402/MR-1(+)细胞的增殖速率无明显改变;划痕实验表明BEL-7402/MR-1(+)细胞越过划痕的能力明显增强;Transwell试验亦表明,BEL-7402/MR-1(+)细胞系迁移能力增强29.7%;粘附实验结果显示,BEL-7402/MR-1(+)在10min,20min,30min以及60min培养后对FN的粘附率明显增加;另外,细胞在FN上的伸展速度变快。5.MR-1在肿瘤增殖、粘附和迁移过程中的作用机制酵母双杂交和体外蛋白结合试验表明,MR-1可以与肌球蛋白轻链2(MLC2)结合。文献报道,MLC2的活性与细胞运动以及转移过程密切相关。MLC2活化后肌球蛋白即可与肌动蛋白结合,促进张力纤维的聚合,进而增强细胞运动。肿瘤细胞的运动转移是一个整体连续的过程,该过程与细胞与基质的粘附有关。当细胞与基质发生粘附后,粘着斑激酶(FAK)激活,FAK可通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号转导通路调节细胞存活。在此基础上,我们开展了MR-1的作用机制研究。(1)MR-1对MLC2、FAK和Akt磷酸化和张力纤维形成的影响检测MR-1-siRNA对细胞内MLC2磷酸化水平以及张力纤维形成的影响,结果表明MR-1-siRNA处理后,细胞内MLC2蛋白的19位丝氨酸磷酸化水平明显降低。罗丹明偶联鬼笔环肽染色检测细胞内张力纤维的形成,结果表明MR-1-siRNA处理后,细胞内F-actin的聚集与对照组细胞相比明显受到抑制。说明MR-1通过某种机制促进MLC2的磷酸化,然后影响F-actin的聚集,进而增强细胞迁移能力。检测MR-1-siRNA对FAK以及Akt活性的影响,结果显示FAK和Akt的磷酸化水平显著下降。另外,MR-1-siRNA也可抑制FN激活的FAK/Akt活性。说明MR-1通过影响FAK/Akt活性调节细胞粘附以及增殖。(2)MR-1激活MLC2-FAK-Akt信号转导通路采用肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂、F-actin解聚剂和PI3K抑制剂处理细胞,检测MLC2、FAK和Akt磷酸化水平以及张力纤维的形成,阐明这些蛋白在信号转导通路中的相互关系。结果显示,给予MLCK抑制剂后,细胞内MLC2磷酸化水平降低,张力纤维形成受抑,同时FAK/Akt活性发生显著降低。给予F-actin解聚剂后,MLC2磷酸化水平上升,而FAK/Akt活性降低,这两组结果说明活化的MLC2通过促进细胞内张力纤维的聚合,作为上游信号因子调节FAK/Akt通路。另外,给予上述抑制剂后,细胞迁移能力以及生长能力均出现不同程度的下降。给予PI3K抑制剂后,除细胞Akt磷酸化水平缺失外,MLC2以及FAK磷酸化水平也发生不同程度的下降,说明Akt还可通过某种机制促进MLC2活性,从而在细胞内形成正反馈信号转导通路,调节细胞粘附、迁移和增殖。而上述三种抑制剂对MR-1表达均无影响。另外,当瞬时转染pcDNA3.1-MR-1使细胞表达外源性MR-1后,细胞内MLC2、FAK和Akt磷酸化水平显著升高,该作用可被MLCK抑制剂阻断,说明MR-1为该信号通路的上游调节因子。(3)MR-1对细胞增殖和运动相关基因表达的影响采用基因芯片技术检测MR-1瞬时沉默细胞以及MR-1高表达细胞中全基因组的变化。HepG2细胞处理30小时后,比较MR-1-siRNA处理细胞与mock-siRNA处理细胞之间基因的差异。结果显示MR-1-siRNA处理组细胞有326个基因发生改变,其中192个基因上调,134个基因发生下调。另外,对比BEL-7402/MR-1(+)细胞与BEL-7402/EV细胞中基因的差异。结果显示BEL-7402/MR-1(+)细胞有1318个基因发生了改变,其中338个基因出现上调,980个基因出现下调。这些受MR-1影响的基因中有很多与细胞增殖和运动相关的基因。信号转导相关基因分析表明,细胞骨架调节、MAPK、细胞周期调节等通路的相关基因均受MR-1的影响。综上所述,MR-1基因可能与肿瘤的发生、发展和转移相关,其作用机制是通过激活MLC2-FAK-Akt信号通路,促进肿瘤细胞增殖、粘附和迁移。MR-1有可能成为肿瘤治疗的新靶点。