膜蛋白是生物膜功能的主要承担者,其结构、功能的研究对了解认识膜蛋白起着至关重要的作用,而研究的前提是纯化膜蛋白。由于膜蛋白一般整合在生物膜上,同时表达量又十分有限,往往难以分离纯化。本论文研究将多角体蛋白基因与膜蛋白基因分别在大肠杆菌和家蚕细胞中实现高效融合表达并开展纯化研究。　　 本研究从本实验室构建的家蚕跨膜蛋白序列cDNA文库中筛选获得一条cDNA序列,将其命名为N141。经生物信息学分析发现该基因编码的蛋白含有保守结构域chitin_bind_4,该序列含有一435 bp的开放阅读框,预测编码144个氨基酸残基,编码蛋白质分子量大小为16.9kDa,有一个跨膜区。根据其ORF框设计上下游引物,PCR扩增目的基因并克隆到载体pBacPAK8-Polh中,构建重组质粒pBacPAK8-Polh-N141。用BamH I和EcoR I双酶切上述重组质粒,将Polh-N141基因片段克隆到载体pET-28a的相应酶切位点,成功构建重组质粒pET-28a-Polh-N141。用IPTG诱导含重组质粒的工程菌表达,裂解菌液经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定发现融合蛋白高效表达且主要以包涵体的形式存在于沉淀中。利用多角体蛋白基因强启动子特性,使得融合蛋白Polh-N141高效表达。利用多角体蛋白的溶解度特性,通过梯度pH洗涤法即梯度pH值的Tris·Cl缓冲液洗涤沉淀来纯化融合蛋白。纯化的融合蛋白经Western blotting和肽指纹图谱证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。将纯化的融合蛋白用TEV酶切去除多角体,以纯化膜蛋白N141。利用多角体蛋白的相关性质,使膜蛋白大量表达且便捷纯化。同时,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将Polh-N141基因片段克隆到载体pFastBacHTb,构建重组质粒pFastBac-Polh-N141并转化DH10Bac E.coli,与家蚕杆状病毒基因组Bacmid发生转座,得到重组杆状病毒基因组并转染家蚕细胞BmN以获取重组杆状病毒vPolh-N141,经重组杆状病毒转染的家蚕细胞发病后,Western blotting鉴定已表达融合蛋白。本研究尝试高效表达并纯化膜蛋白,为对其进行结构功能研究奠定基础。