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恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重大疾病.肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)是恶性肿瘤的"种子"细胞,其独具自我更新、多潜能分化和体内重建肿瘤的能力,在肿瘤发生、演进、侵袭转移、耐药和复发等恶性表型中发挥重要作用.肿瘤干细胞的"干性"即呈现干细胞特征的状态,瘤细胞群体中已分化的肿瘤细胞可通过重获"干性"而转变为肿瘤干细胞.然而,肿瘤细胞重获"干性"的机制及阻抑策略尚待进一步研究.肿瘤细胞最重要的代谢特征是无论处于缺氧还是常氧环境中均优先利用糖酵解而非氧化磷酸化来获取能量,此现象被称为Warberg效应.肿瘤干细胞糖酵解能力远强于已分化肿瘤细胞,这一代谢特征使得其更加适应恶劣的生存环境.肿瘤干细胞糖酵解调控机制尚不清楚.因此,阐明肿瘤细胞"干性"获得和糖代谢异常的分子机制将为恶性肿瘤治疗提供新思路. 胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤,其中约50%为恶性程度最高的胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM,WHO Ⅳ级).尽管近年来GBM的治疗方式和策略取得了诸多进步,患者的预后仍然没有得到显著改善,中位生存期约为 12-15 个月,5年生存率不足 5%.胶质瘤是最早分选得到肿瘤干细胞的实体瘤之一,评估胶质瘤细胞"干性"的指标已得到公认;此外,胶质瘤细胞中糖代谢也存在明显异常,其具体调控仍待阐明.因此,我们以胶质母细胞瘤为模型,研究了胶质瘤细胞"干性"获得和糖代谢异常的调控机制,主要结果和结论如下: 第一部分 STC1对胶质瘤细胞干性表型的调控作用及分子机制 我们课题组前期通过成球培养的方法富集胶质瘤干细胞(Glioma Stem Cells, GSCs),并通过与对应的在含有血清条件下培养的分化的胶质瘤细胞进行基因表达谱芯片分析,发现了一些差异性表达的基因.我们发现一种分泌型糖蛋白-斯钙素 1 (Stanniocalcin 1,STC1)在胶质瘤成球细胞中显著高表达.在胶质瘤临床样本中STC1的表达与干性标志物CD133呈现明显的共定位现象,因此进一步研究了STC1对胶质瘤细胞干性表型的影响及其分子机制.本部分的主要方法、结果和结论如下: 1、STC1表达与胶质瘤级别呈正相关,与患者预后呈负相关 TCGA、Rembrandt和Gravendeel数据库分析发现STC1的表达随着胶质瘤级别的升高而增高,与胶质瘤患者的预后呈现显著负相关,提示 STC1 在胶质瘤中可能有诊断和判断预后的价值. 2、STC1能增强胶质瘤细胞的干性表型 (1)通过成球培养的方法富集胶质瘤干细胞,用PCR、Western Blot以及ELISA等方法证实STC1在胶质瘤干细胞中高表达. (2)通过免疫荧光染色发现胶质瘤组织中 STC1 与胶质瘤干细胞标志物 CD133存在共定位. (3)在体外培养的胶质瘤细胞中加入重组 STC1,能显著增强细胞干性标志物(CD133,Sox2,Oct4,Nanog)的表达,增强细胞的体外成球能力和克隆形成能力. (4)在胶质瘤细胞中过表达STC1或者敲低STC1的表达,通过体外实验发现内源性过表达STC1可以显著上调胶质瘤细胞Sox2和CD133等干性标志物的表达,增强细胞的成球能力和克隆形成能力.而在胶质瘤细胞中敲低 STC1 的表达后,细胞的干性标志物下调、成球能力和克隆形成能力降低. (5)通过动物原位移植瘤实验发现STC1过表达可以明显促进移植瘤生长,缩短荷瘤鼠生存期,而敲低 STC1 后胶质瘤细胞的成瘤能力显著降低,荷瘤鼠生存期明显延长. 3、STC1能够与Notch1胞外段直接作用,激活Notch1-Sox2通路而增强胶质瘤细胞的干性表型 (1)在过表达STC1的胶质瘤细胞中筛选调控自我更新的关键通路(Notch通路、Wnt 通路和 Hedgehong 通路等),我们发现 STC1 过表达后 Notch 通路的关键分子Notch1的胞内段N1ICD(Intracellular domain of Notch1,N1ICD)显著上调,而Wnt通路的β-cantenin和Hedgehong通路的Gli1无明显变化,提示STC1在胶质瘤细胞中能够激活Notch信号通路. (2)在胶质瘤细胞中加入外源性 rSTC1 或者内源性过表达 STC1 后,细胞的N1ICD和Sox2表达升高.而在胶质瘤细胞中敲低STC1后,N1ICD和Sox2表达显著降低.利用 STC1的中和抗体或者用 Notch信号通路的抑制剂 DAPT则能抑制 STC1对 N1ICD 和 Sox2表达的增强作用.另外,在胶质瘤细胞中过表达 Sox2能部分回复由于 STC1 降低而引起的成球能力的降低.以上研究结果证明了 STC1 通过Notch1-Sox2信号通路增强了胶质瘤细胞的干性表型. (3)在胶质瘤中,STC1、N1ICD和Sox2表达存在正相关性.在胶质瘤细胞(细胞系和原代细胞)和临床胶质母细胞瘤病人样本中均发现STC1与N1ICD呈正相关. (4)在胶质瘤临床样本中,发现STC1与Notch1的胞外段(Extracellular domain of Notch1,NIECD)存在明显的共定位现象.在胶质瘤细胞中通过Co-IP实验发现STC1和NIECD存在相互作用.进一步在293T细胞中的Co-IP实验和体外GST pull-down实验证实STC1能与NIECD的1-24 EGF-repeats直接作用. (5)STC1与NIECD的结合是有功能的,能够引起N1ICD剪切入核,调控下游靶基因的表达,增强胶质瘤细胞的干性表型. 我们的结果首次证实STC1是一个Notch通路非经典的调控蛋白,能够增强胶质瘤细胞的干性表型,可能是一个潜在的治疗靶点. 第二部分 STC1对胶质瘤细胞糖酵解的影响及分子机制 上一部分研究中,我们发现 STC1 能够促进胶质瘤细胞的干性表型.既往有研究表明间充质干细胞通过分泌 STC1 增强肿瘤细胞 Warberg效应,但是其具体的机制仍不明确.此外,有研究表明肿瘤干细胞更加趋向利用糖酵解来产生能量.本部分探讨STC1对胶质瘤细胞糖酵解的影响及其分子机制,实验方法、结果及结论如下: 1、STC1能促进胶质瘤细胞的糖酵解.在胶质瘤细胞中过表达STC1后,细胞的葡萄糖吸收量和乳酸生成量显著升高,糖酵解关键酶 HK2和 LDHA表达升高.而在胶质瘤细胞中敲低 STC1 的表达后,细胞葡萄糖吸收量和乳酸生成量显著降低,HK2和LDHA的表达显著降低.以上结果表明STC1能正向调控胶质瘤细胞的糖酵解. 2、通过质谱的方法鉴定在胶质瘤细胞中 STC1 可能的相互作用蛋白.通过分析质谱鉴定出的蛋白,我们发现一种膜蛋白,成纤维细胞生长因子受体 1(Fibroblast Growth Factor Receptor 1,FGFR1),可能是STC1的一个相互作用蛋白.通过Co-IP和GST pull-down实验证实STC1和FGFR1在胶质瘤细胞中确实存在结合. 3、STC1通过FGFR1-Akt轴增强胶质瘤细胞的糖酵解.STC1对胶质瘤细胞糖酵解的增强作用能够被 FGFR1的抑制剂(PD-166866)和 Akt的抑制剂(MK-2206)所抑制,表现为葡萄糖吸收降低,乳酸产生降低,糖酵解关键酶HK2和LDHA表达降低. 以上结果证实STC1通过FGFR1-Akt信号轴增强胶质瘤细胞的糖酵解. 第三部分LincRNA-RoR通过调控STC1的表达抑制胶质瘤细胞糖酵解 长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)在多种生物过程中发挥了重要作用.LincRNA-RoR是首先在iPS和胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)中发现的在维持干性表型中发挥重要作用的 LncRNA.通过文献我们发现LincRNA-RoR (Long intergenic non-protein coding RNA, Regulator of Reprogramming)能够调控 STC1 的表达,但是其是否能影响糖酵解尚未报道.本部分我们研究了LincRNA-RoR对胶质瘤细胞STC1表达及糖酵解的调控作用,实验方法、结果及结论如下: 1、 LincRNA-RoR抑制胶质瘤细胞糖酵解 (1)LincRNA-RoR 能抑制胶质瘤细胞 STC1 表达并且能抑制胶质瘤干细胞的自我更新能力. (2)通过PCR检测 GBM临床样本和胶质瘤细胞系中LincRNA-RoR的表达,结果显示,与瘤旁组织和正常星形胶质细胞相比,LincRNA-RoR在胶质瘤肿瘤组织中和胶质瘤细胞中显著低表达. (3)过表达LincRNA-RoR后,胶质瘤细胞的葡萄糖吸收量和乳酸的产生量明显减少,而总 ATP 产量升高,提示糖酵解受到抑制,细胞趋向有氧呼吸.利用小干扰 RNA敲低LincRNA-RoR的表达后,胶质瘤细胞的葡萄糖吸收量和乳酸的产生量明显增加,而ATP含量降低,提示细胞的无氧呼吸增强. (4)体外实验发现LincRNA-RoR能显著抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力.体内实验证实LincRNA-RoR能抑制移植瘤生长. 以上结果说明LincRNA-RoR能抑制胶质瘤细胞糖酵解,降低细胞的增殖能力和侵袭能力. 2、LincRNA-RoR通过降低STC1的表达抑制Akt信号通路进而抑制胶质瘤细胞糖酵解 (1)在胶质瘤细胞中过表达LincRNA-RoR能显著抑制p-Akt,p-mTOR和p-S6等Akt信号通路关键分子的表达,说明Akt信号通路受到抑制. (2)通过Western blot和免疫组织化学染色检测糖酵解关键蛋白的表达,发现LincRNA-RoR能显著抑制Glut1、HK2、PKM2、LDHA的表达,在体外细胞和体内移植瘤样本中均得到了验证. (3)STC1 能够部分回复 LincRNA-RoR 导致的细胞葡萄糖吸收降低和乳酸生成水平降低. (4)TCGA数据库分析发现Glut1、HK2、PKM2和LDHA的表达与GBM患者的预后呈现明显的负相关. 以上结果提示LincRNA-RoR通过抑制Akt通路进而抑制糖酵解效应分子的表达,从而抑制胶质瘤细胞的糖酵解,降低细胞的侵袭和增殖能力. 总之,我们的结果首次证实STC1是一种NOTCH信号通路的非经典调控蛋白,并首次证实其在肿瘤细胞"干性"表型维持中的重要作用,同时还首次发现 STC1 能通过 FGFR1-Akt 信号轴增强胶质瘤细胞的糖酵解水平.此外,我们还发现LincRNA-RoR能负向调控STC1的表达,并证实其对肿瘤细胞糖酵解的调控作用.以上研究结果为针对肿瘤干细胞和胶质瘤糖代谢的靶向治疗提供了新的靶点.