CD40分子是肿瘤坏死因子受体超家族的成员,不仅仅表达于正常的淋巴细胞中,而且在大多数的造血恶性肿瘤和上皮恶性肿瘤中也存在广泛的表达。因为CD40分子在免疫反应中的中心地位,它在自身免疫性疾病的发病机制中也扮演着非常中的作用。近年来许多证据甚至表明CD40信号转导通路在癌症的发生发展中也有着重要作用。由于CD40信号转导通路在自身免疫性疾病和血液系统恶性肿瘤的发病机制中发挥着非常重要的作用,已经有一些针对CD40信号转导通路的药物已经处于开发、研制状态。因此通过各种研究技术和手段深入研究CD40信号转导通路的分子机制,以期寻找疾病诊断的分子标记物以及治疗的药物靶标已成为目前研究的热点。为了深入研究CD40信号转导通路涉及的大分子蛋白及其功能,本研究主要应用高效液相色谱-串联质谱的方法,鉴定出CD40信号复合体中的新组分,并对新组分的功能进行了初步探讨。　　本研究应用基于内源免疫沉淀实验结合质谱鉴定的方法对A20细胞(小鼠B细胞淋巴瘤细胞系)中CD40配体诱导形成的CD40信号复合体作为样品进行分析。首先,将A20细胞用anti-CD40刺激10min或者不处理,然后每组分别用CD40抗体或IgG抗体进行免疫沉淀,接着应用SDS-PAGE对免疫沉淀复合物进行分离,电泳后的凝胶用考马斯亮蓝染料进行染色处理,确定差异蛋白质的条带。对一些差异蛋白条带进行胶内酶切,并通过高压液相色谱-串联质谱测序,最后通过Mascot检索软件的MS/MS离子方式检索数据库检索鉴定蛋白质。通过检索PUBMED文献或其它的数据库,对鉴定的差异蛋白质的生物学功能进行了解和分类,为进一步深入研究这些差异蛋白的功能以及其在信号转导通路中的作用打下了一定的基础。同时对感兴趣的差异的蛋白质利用内源免疫沉淀实验进行验证,并对其在信号功能中的作用进行初步探索。　　对电泳分离的免疫沉淀复合物用考马斯亮蓝染料染色处理之后,对30个差异蛋白条带进行了胶内酶切和质谱鉴定,共鉴定出246个有意义的蛋白质,这些差异蛋白质的功能分类如下:与细胞代谢相关的54个,与细胞结构蛋白相关的11个,与蛋白降解系统相关的12个,与信号传导相关的29个,与转录和翻译相关的55个。在这些蛋白质中,有些与CD40信号转导通路有关,如:MAPKK1、JNK(stress-activated protein kinase,SAPK)、PI3K等;有些蛋白与细胞死亡相关,如Dynactin。这些蛋白为研究CD40信号转导通路及其在疾病发生中的作用提供了重要线索,对差异的蛋白质进行细胞水平的验证以及在相关信号转导通路中的具体作用还需要进一步更深入的研究。　　细胞膜上的CD40分子与其配体结合后,可以使CD40分子之间交联产生三聚化,进而招募接头蛋白TRAFs及NEMO,而TRAFs及NEMO的泛素化是CD40分子诱导的不同信号通路激活的重要事件,因而作为质谱鉴定出的差异蛋白中与泛素相关的一些蛋白,如NEDD4、USP9X、E4B等就成为本研究的重要焦点;而ROCKs是RhoA的直接下游靶蛋白,参与多种细胞功能,如平滑肌的收缩,细胞骨架的构建,细胞的粘附与运动等,且越来越多的实验证据表明ROCKs在发育过程及其它许多生理病病理过程中发挥重要的调控作用,但是它发挥作用的具体机制尚不明确,所以质谱鉴定出的差异蛋白ROCK1也称为本研究的另一焦点。应用体内免疫共沉淀实验对NEDD4、USP9X、E4B及ROCK1进行验证,结果显示出NEDD4及ROCK1均与CD40有相互作用,且这种相互作用不依赖于CD40配体的刺激;USP9X和E4B在本实验条件下没有显示出相互作用(结果未展示)。　　NEDD4通过内源免疫沉淀实验验证后,本研究又用外源共转染NEDD4质粒及NEMO、IKK?、IKKα、TRAF2、TRAF3等的质粒进行免疫共沉淀的方法,发现NEDD4与NEMO、TRAF3之间有相互作用,而与TRAF2无相互作用(TRAF2、TRAF3与NEDD4间的相互作用由本实验室方迪峰硕士完成),而且NEDD4能够使NEMO、TRAF3发生泛素化(NEDD4对TRAF3的泛素化由本实验室方迪峰硕士完成)。接着为了探讨NEDD4在通路中的作用,又构建了慢病毒三质粒载体系统用来建立NEDD4稳定干涉的A20亚细胞系,但遗憾的发现,由于慢病毒作用A20细胞后,引起细胞中CD40分子蛋白表达量上调,使得此稳定细胞系不适合用来进行CD40信号通路的探讨研究;为此我们又设计了针对NEDD4的特异siRNA对A20细胞进行瞬时干涉,接着用CD40配体去刺激细胞然后检测通路变化,结果没有检测到明显的变化;在NEDD4-/-的MEF细胞中TNF通路及EGF通路也没有检测到明显的变化。　　为了进一步研究ROCK1在CD40信号通路中的功能,本研究利用ROCK的抑制剂Y-27632预处理A20细胞,发现添加了抑制剂Y-27632之后,CD40通路下游p-JNK的激活受到了一定程度的抑制。　　本研究应用高压液相色谱-串联质谱技术鉴定了246个可能的CD40信号复合体中新组分,并对差异蛋白NEDD4及ROCK1的功能进行了初步研究,为以后深入研究CD40信号通路的分子机制和作用,以及为寻找疾病诊断的分子标记物和治疗的药物靶标提供了一定的基础。