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鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma)是一种具有显著种族和地域分布特点的上皮源性恶性肿瘤,好发于我国南方各省及东南亚地区,而在我国北方和欧美人中少见。其发病率在我国的南方各省约为25-50/100000,是西方国家的100倍。越来越多的研究表明鼻咽癌的病因与多种因素相关,包括病毒感染、遗传因素和环境因素等。由于遗传易感性(HLA单体型等)、EB病毒的感染及经常暴露于众多的致癌因素之下而导致新生细胞的无序生长,从而诱发鼻咽癌。同时,调节细胞增殖、凋亡、细胞周期、基因组稳定性及鼻咽细胞分化的关键基因由于遗传因素(如基因扩增、缺失与突变)与外界因素(甲基化)而改变是鼻咽癌发生发展的重要原因。然而,鼻咽癌发病的分子基础还远未清楚。因此,更好的了解鼻咽癌发生的分子机制是更好的诊断、预防、治疗鼻咽癌的基础。
【LPS与鼻咽癌发生发展的关系】鼻咽是呼吸系统与消化系统的共同组成部分,无时无刻不暴露和接触到共生微生物与病原微生物,机体依靠天然防御系统和抗原识别的适应性免疫反应系统来进行自我保护。当机体整体或局部的防御机制受到破坏,病原微生物就会在机体局部产生炎症,长期的慢性炎症是病原微生物致肿瘤发生的关键因素。慢性感染的重要毒力因素被认为是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分LPS,对LPS的识别与信号传导是宿主细胞抵御革兰氏阴性细菌的关键。我们应用BrdU掺入实验、MTT等实验证实了LPS可促进鼻咽癌细胞系HNE1和5-8F细胞的生长与增殖。通过流式细胞、RT-PCR等研究还发现鼻咽癌细胞可与LPS相结合且其受LPS调节的机制是由于鼻咽癌细胞中存在LPS受体分子如CD14、TLR4与MD2等的表达。同时应用免疫荧光、western-blot、荧光素酶报告系统等研究发现,鼻咽癌细胞(HNE1、5-8F)可受到LPS的诱导而活化NFκB与MAPK信号传导通路。鼻咽癌细胞在LPS的诱导下,NFκBp65的表达增加,并且使NFκBp65活化迁移至核内;同时在LPS的诱导下,鼻咽癌细胞MEK1、ERK1/2和JNK1/2表达增加,并且ERK1/2和JNK1/2被激活而进入核内。NFκB与MAPKs的过度活化是导致细胞增殖与恶性变的重要机制。同时我们研究还发现LPS增加TNF-α全长启动子活性而对缺失了NFκB结合位点的TNF-α启动子启动子活性无明显的改变,同时LPS可使鼻咽癌细胞中TNF-α的分泌增加,从而介导炎性因子的释放。因此长期的慢性炎症使NFκB与MAPK信号传导通路过度活化,可导致鼻咽癌的发生,LPS介导的信号通路可能是鼻咽癌发生发展的重要分子机制之一。
【LPLUNC1抑制LPS所介导的信号传导通路】LPLUNC1基因是我室采用联合抑制性消减杂交和cDNAmicroarray技术分离鼻咽癌差异表达基因的方法克隆的鼻咽组织特异性表达新基因。我们以往的研究表明,该基因在71%的鼻咽癌患者中表达下调,而在正常的成人鼻咽组织及人胚鼻咽组织中为高表达,这些都提示LPLUNC1可能在鼻咽癌的发生发展中起非常重要的作用。我们通过构建LPLUNC1的真核表达载体,并将其稳定转染入5-8F、HNE1鼻咽癌细胞系中,建立5-8F/pEGFP-C2-LPLUNC1与HNE1/pcDNA3.1(+)-LPLUNC1稳定转染细胞系。结果发现:LPLUNC1可抑制LPS所诱导的鼻咽癌细胞增殖反应。通过western-blot、免疫荧光等一系列的实验证实,LPLUNC1可阻断LPS所诱导的鼻咽癌上皮细胞NFκBp65、ERK1/2和JNK1/2的表达及活化。同时通过瞬时共转染LPLUNC1与TNF-α荧光素酶报告系统证实LPLUNC1可抑制TNF-α全长启动子的活性,ELISA结果也证实了LPLUNC1可抑制鼻咽癌细胞受LPS刺激导致的TNF-α的产生,抑制炎性因子的释放。因此,LPLUNC1可能通过阻断LPS介导的NFκB与MAPK信号传导通路而抑制鼻咽癌的发生发展。
【LPLUNC1通过延缓细胞周期进程而抑制鼻咽癌的发生发展】细胞周期进程是一个由众多分子参与的严格调控的过程,失去对细胞周期正常的精细调控是大多数肿瘤发生发展的分子机制之一,因此,恶性肿瘤往往被称为细胞周期疾病。哺乳动物细胞周期通常由cyclin-CDK复合物所调控。我们通过对鼻咽癌细胞的细胞生物学研究进一步证实LPLUNC1可抑制鼻咽癌细胞生长与增殖,并使鼻咽癌细胞的集落形成减少并降低其裸鼠的成瘤性。经流式细胞分析发现LPLUNC1可引起5-8F细胞周期分布发生明显改变:G1期细胞明显增加,S期细胞相应减少,因此,LPLUNC1可延缓鼻咽癌细胞的细胞周期G1-S期进程。随后,我们又应用cDNA-microarray研究了LPLUNC1的表达对鼻咽癌细胞系5-8F细胞基因表达谱的影响,结果筛选出了369个差异表达基因,其中有175个为下调基因,194个为表达上调基因,而这些差异表达基因中有19个基因与MAPK(如MAP4K5、MAP3K1和MAPK9等)及细胞周期(如E2F5、CDK7、CDK8、p27kip1等)密切相关,其结果部分通过western-blot证实,说明Microarray是可靠的。同时western-blot证实LPLUNC1可抑制MEK1、ERK1/2、JNK1/2及下游c-MYC、c-JUN等的表达。且LPLUNC1可抑制MAPKs信号通路的活化。我们进一步通过western-blot、流式细胞分析和荧光素酶报告系统研究证实LPLUNC1可抑制cyclinD1、CDK4和CDK8的表达及RB的磷酸化,明显下调cyclinD1及E2F3启动子的活性,并抑制转录因子AP1的活性。因此,LPLUNC1可通过下调MAPKs信号传导通路而抑制cyclinD1与CDK4的表达,并降低E2F的活性,从而抑制细胞周期进程,参与调节鼻咽癌的发生发展。
【BPI结构域是参与调节鼻咽癌发生发展的LPLUNC1的重要功能域】LPLUNC1基因是属于BPI/PLUNC基因超家族的新成员。生物信息学预测LPLUNC1蛋白含有2个BPI结构域。BPI蛋白是一种分子量约55kD的阳离子分泌蛋白,具有结合脂多糖(LPS),中和内毒素和杀灭细菌作用,同时也是一种内源性血管生成抑制剂并可抑制肿瘤的转移。其分子机制可能是BPI与LBP竞争性地结合LPS,阻止LPS与LBP结合所启动的信号传导通路。因此,BPI结构域可能是LPLUNC1重要的功能域。为了证实我们的科学假说,我们构建了缺失BPI结构域的LPLUNC1缺失突变体。研究发现,LPLUNC1全长定位于细胞浆,同时在细胞中可呈点状聚集,而缺失BPI结构域的LPLUNC1在细胞中不出现点状聚集,且其分布可出现在胞浆或胞核中,说明BPI结构域对LPLUNC1的亚细胞定位发挥了重要作用。同时我们还发现:BPI结构域的缺失导致了LPLUNC1抑制鼻咽癌细胞生长与增殖功能的丧失,其抑瘤性也丧失。缺失BPI结构域的LPLUNC1对细胞周期的阻滞变得不明显,对NFκB、TNF-α、E2F3、cyclinD1及AP1等信号通路分子的活性也没有影响。由此可见,BPI结构域是LPLUNC1的重要功能域。
因此,LPS所导致的慢性炎症参与了鼻咽癌的发生发展,而LPLUNC1基因通过其BPI结构域阻断LPS介导的NFκB与MAPK信号传导通路而抑制鼻咽癌的发生发展;同时LPLUNC1可通过下调MAPKs与cyclinD1/E2F信号传导通路,延缓细胞周期进程而抑制鼻咽癌的发生发展。