论文部分内容阅读
目的：骨肉瘤（OS）是儿童和青少年常见的一种原发性恶性肿瘤，早期比较容易发生转移，致死率和致残率较高，通常预后较差。化疗是治疗术后骨肉瘤的一个重要的治疗措施,对提高手术的成功率和降低死亡率具有重要的作用，因此我们迫切需要找到新型、有效、副作用小的抗肿瘤药物。辛可宁（Cinchonine CIN）是从金鸡纳树皮中提取的，它通常和奎尼丁联合应用于疟疾的治疗。有学者发现辛可宁也具有抗肿瘤的作用，且具有较低的毒性和较高的疗效。有相关文献报道辛可宁在多重耐药的MES-SA/Dx5子宫平滑肌肉瘤细胞中具有促进凋亡的作用。最近研究发现，辛可宁在HELA和A549细胞中具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。但是到目前为止，它对骨肉瘤生长的影响及其作用机制，我们还不清楚。
方法：在本次研究中，用不同浓度的辛可宁作用于143B和U2骨肉瘤细胞48小时后，用CCK-8法检测辛可宁对骨肉瘤细胞的增殖能力，用平板克隆观察骨肉瘤细胞的集落形成能力。为了了解辛可宁对骨肉瘤的增殖的影响是否与肿瘤细胞的凋亡有关，用辛可宁处理143B和U2两种骨肉瘤细胞后，用TUNEL观察骨肉瘤细胞的凋亡率，用免疫荧光观察凋亡蛋白cleaved-PRPA1的表达情况、用Western Blot法检测0umol/L、150umol/L、280umol/L不同浓度的辛可宁作用骨肉瘤细胞后的凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3、cleaved-PRPA1）的表达情况，同时观察内质网应激相关蛋白(p-EIF2a、CHOP、自噬相关蛋白P62、LC3Ⅰ/Ⅱ）的表达情况。对照组、辛可宁组、辛可宁+4-PBA、4-PBA组干预骨肉瘤细胞48小时，用TUNEL检测细胞的凋亡情况，用Western Blot法检测细胞内质网应激蛋白p-EIF2a、CHOP和凋亡蛋白cleaved-caspase3和cleaved-PARP1及自噬蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和P62的表达情况。在体外实验的基础上，我们通过体内实验进一步验证辛可宁对骨肉瘤的作用及相关机制。把143BOS细胞接种在裸鼠皮下，成瘤后，将裸鼠随机分为两组，分别用辛可宁和DMSO作用21天，随后将肿瘤从裸鼠体内解剖出瘤体进行称重，并进行HE染色和免疫组化检测。
结果：骨肉瘤细胞暴露于浓度为0umol/L，100umol/L，150umol/L，200umol/L、240umol/L、250umol/L、260umol/L、280umol/L、300umol/L的辛可宁中观察到两种骨肉瘤细胞的抑制率随着药物浓度的升高而升高。平板克隆实验显示，随着药物浓度的增加肿瘤细胞的克隆形成能力逐渐降低。应用TUNEL检测对骨肉瘤细胞的凋亡能力的影响，与对照组相比辛可宁组骨肉瘤细胞的凋亡率明显增加。辛可宁作用于骨肉瘤48小时后，凋亡蛋白（cleaved-PARP1和cleaved caspase-3）随着辛可宁浓度的增加而增加，具有浓度依赖性。将骨肉瘤细胞暴露于0umol/L、150umol/L、280umol/L的辛可宁下，内质网应激蛋白p-EIF2a、CHOP和自噬相关蛋白LC3Ⅱ随着辛可宁浓度的增加而增加，然而P62的表达随着辛可宁浓度的增加而减少，结果显示辛可宁具有诱导内质网应激和自噬的作用。将骨肉瘤细胞分别暴露于对照组、辛可宁组、辛可宁+4-PBA、4-PBA组，发现辛可宁具有上调内质网应激蛋白p-EIF2a、CHOP、自噬相关蛋白LC3Ⅱ和凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、cleaved-PARP1的表达，而下调P62的表达的作用，然而4-PBA具有减弱辛可宁诱导的内质网应激蛋白p-EIF2a、CHOP和自噬相关蛋白LC3Ⅱ而增加P62的表达的作用，说明辛可宁具有通过内质网应激相关通路诱导自噬性细胞死亡和凋亡的作用。为了进一步验证辛可宁的抗肿瘤活性，在体内实验中应用143B骨肉瘤细胞进行裸鼠成瘤研究辛可宁的抗肿瘤特性。当裸鼠皮下成瘤后，将裸鼠随机分成两组，应用辛可宁和DMSO对骨肉瘤干预21天，发现辛可宁治疗组肿瘤的体积和重量都小于DMSO治疗组。将标本进行HE染色发现辛可宁治疗组，肿瘤组织出现大面积的坏死和核溶解。将肿瘤标本行免疫组化检查可见辛可宁治疗组p-EIF2a、CHOP、自噬相关蛋白LC3Ⅱ和凋亡蛋白cleaved-caspase3的表达高于DMSO组。
结论：通过体内外实验验证了辛可宁通过内质网应激相关通路促进骨肉瘤细胞死亡。
方法：在本次研究中，用不同浓度的辛可宁作用于143B和U2骨肉瘤细胞48小时后，用CCK-8法检测辛可宁对骨肉瘤细胞的增殖能力，用平板克隆观察骨肉瘤细胞的集落形成能力。为了了解辛可宁对骨肉瘤的增殖的影响是否与肿瘤细胞的凋亡有关，用辛可宁处理143B和U2两种骨肉瘤细胞后，用TUNEL观察骨肉瘤细胞的凋亡率，用免疫荧光观察凋亡蛋白cleaved-PRPA1的表达情况、用Western Blot法检测0umol/L、150umol/L、280umol/L不同浓度的辛可宁作用骨肉瘤细胞后的凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3、cleaved-PRPA1）的表达情况，同时观察内质网应激相关蛋白(p-EIF2a、CHOP、自噬相关蛋白P62、LC3Ⅰ/Ⅱ）的表达情况。对照组、辛可宁组、辛可宁+4-PBA、4-PBA组干预骨肉瘤细胞48小时，用TUNEL检测细胞的凋亡情况，用Western Blot法检测细胞内质网应激蛋白p-EIF2a、CHOP和凋亡蛋白cleaved-caspase3和cleaved-PARP1及自噬蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和P62的表达情况。在体外实验的基础上，我们通过体内实验进一步验证辛可宁对骨肉瘤的作用及相关机制。把143BOS细胞接种在裸鼠皮下，成瘤后，将裸鼠随机分为两组，分别用辛可宁和DMSO作用21天，随后将肿瘤从裸鼠体内解剖出瘤体进行称重，并进行HE染色和免疫组化检测。
结果：骨肉瘤细胞暴露于浓度为0umol/L，100umol/L，150umol/L，200umol/L、240umol/L、250umol/L、260umol/L、280umol/L、300umol/L的辛可宁中观察到两种骨肉瘤细胞的抑制率随着药物浓度的升高而升高。平板克隆实验显示，随着药物浓度的增加肿瘤细胞的克隆形成能力逐渐降低。应用TUNEL检测对骨肉瘤细胞的凋亡能力的影响，与对照组相比辛可宁组骨肉瘤细胞的凋亡率明显增加。辛可宁作用于骨肉瘤48小时后，凋亡蛋白（cleaved-PARP1和cleaved caspase-3）随着辛可宁浓度的增加而增加，具有浓度依赖性。将骨肉瘤细胞暴露于0umol/L、150umol/L、280umol/L的辛可宁下，内质网应激蛋白p-EIF2a、CHOP和自噬相关蛋白LC3Ⅱ随着辛可宁浓度的增加而增加，然而P62的表达随着辛可宁浓度的增加而减少，结果显示辛可宁具有诱导内质网应激和自噬的作用。将骨肉瘤细胞分别暴露于对照组、辛可宁组、辛可宁+4-PBA、4-PBA组，发现辛可宁具有上调内质网应激蛋白p-EIF2a、CHOP、自噬相关蛋白LC3Ⅱ和凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、cleaved-PARP1的表达，而下调P62的表达的作用，然而4-PBA具有减弱辛可宁诱导的内质网应激蛋白p-EIF2a、CHOP和自噬相关蛋白LC3Ⅱ而增加P62的表达的作用，说明辛可宁具有通过内质网应激相关通路诱导自噬性细胞死亡和凋亡的作用。为了进一步验证辛可宁的抗肿瘤活性，在体内实验中应用143B骨肉瘤细胞进行裸鼠成瘤研究辛可宁的抗肿瘤特性。当裸鼠皮下成瘤后，将裸鼠随机分成两组，应用辛可宁和DMSO对骨肉瘤干预21天，发现辛可宁治疗组肿瘤的体积和重量都小于DMSO治疗组。将标本进行HE染色发现辛可宁治疗组，肿瘤组织出现大面积的坏死和核溶解。将肿瘤标本行免疫组化检查可见辛可宁治疗组p-EIF2a、CHOP、自噬相关蛋白LC3Ⅱ和凋亡蛋白cleaved-caspase3的表达高于DMSO组。
结论：通过体内外实验验证了辛可宁通过内质网应激相关通路促进骨肉瘤细胞死亡。