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奶牛乳腺炎是严重危害奶牛健康的主要疾病之一,包括临床型乳腺炎和隐性乳腺炎两种类型。临床型乳腺炎具有明显的临床症状,诊断较为容易；隐性乳腺炎则缺乏临床症状,必须借助实验室手段才能进行诊断。长期以来,临床上建立隐性乳腺炎的诊断方法主要依赖于直接或间接计数牛奶体细胞(somatic cell)或对乳汁进行微生物培养。近年来,通过检测牛奶中的急性时相蛋白(acute phase protein, APP)以建立奶牛隐性乳腺炎的诊断逐渐受到重视。结合珠蛋白(haptoglobin, Hp)是牛的一种主要APP,该物质主要由肝脏合成,在正常牛奶中含量极低以致无法检出。在奶牛乳腺炎发生过程中,由于血-乳屏障的通透性升高,Hp可通过血-乳屏障进入到牛奶中。因此,牛奶中Hp含量升高被认为是奶牛发生乳腺炎的标志之一。尽管目前已有用于检测Hp的商品化ELISA检测试剂盒,但其检测过程耗时较长、自动化程度低,不适应现场检测的要求。免疫传感器检测技术是近年来发展起来的一种新型检测技术,其基本检测原理与ELISA方法相似,但可将抗原-抗体反应信号通过电化学传感装置进行放大和输出,从而实现快速、灵敏和自动化检测。本研究的目的在于构建检测牛奶中Hp含量的免疫传感器,以期为诊断奶牛隐性乳腺炎提供新的技术和方法。本研究内容分为三部分。第一部分,在普鲁士蓝／邻苯二胺／纳米金修饰电极上组装牛结合珠蛋白抗体的电流型免疫传感器的研制。以电化学三电极系统为基本装置,以金电极为工作电极,铂丝电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,通过电沉积方法将普鲁士蓝(PB)沉积于金电极表面,在其上电聚合邻苯二胺(o-PDA)以防止PB渗漏,并依次将纳米金颗粒和抗牛Hp抗体(浓度为5.0 mg／L)组装到金电极表面,制得免疫传感器。该传感器工作电极在Hp抗原溶液中的最适孵育时间为15min,扫描底液最适pH值为6-7。在最适检测条件下,该传感器对Hp的检测灵敏度在5-10mg／L之间。第二部分,在L-半胱氨酸／纳米金修饰电极上固定结合珠蛋白抗体的免疫传感器的研究。以三电极系统中的金电极为工作电极,采用层层自组装技术将L-半胱氨酸、纳米金颗粒和抗牛Hp(浓度为5.0 mg／L)抗体依次组装在工作电极上,制成免疫传感器。制成的免疫传感器对Hp的线性检测范围为15-100mg／L,最低检测限为0.63mg／L。分别采用该传感器和ELISA检测试剂盒对隐性乳腺炎患牛乳样中Hp含量进行检测,结果表明该两种方法的检测结果之间无显著差异(P>0.05)。第三部分,免疫传感器诊断法与常用隐性乳腺炎诊断法的比较。在杭州市近郊某奶牛场选取20头临床健康奶牛作为实验对象。随机选取每头奶牛的前后两个乳区采集奶样,采用乳汁病原菌培养法、HMT法、SCC法以及本研究构建的L-半胱氨酸／纳米金／Hp抗体免疫传感器诊断隐性乳腺炎。分别以细菌学检测阳性、HMT检测阳性(评分等级为1-3)、SCC≥50×104个／ml和Hp≥3.9mg/L为隐性乳腺炎的诊断标准。对各种方法的诊断结果采用卡方检验进行差异显著性分析,并采用Kappa检验进行诊断符合率分析。卡方检验结果表明,传感器诊断方法得出的隐性乳腺炎阳性和阴性诊断结果与SCC法诊断结果之间差异显著(P<0.05),但与乳汁病原菌培养法和HMT法诊断结果之间差异不显著(P>0.05)。Kappa检验结果亦表明,传感器检测方法与SCC法诊断结果符合率较低(Kappa< 0.40),但与细菌学检测方法和HMT检测方法得到的诊断结果相符合(Kappa> 0.40).上述结果表明,本研究构建的L-半胱氨酸／纳米金／Hp免疫传感器可用于诊断奶牛隐性乳腺炎。综上,本研究分别采用普鲁士蓝／邻苯二胺／纳米金修饰电极和L-半胱氨酸／纳米金修饰电极固定Hp抗体,制备成了检测Hp抗原的免疫传感器,其中L-半胱氨酸／纳米金/anti-Hp免疫传感器可用于诊断奶牛隐性乳腺炎。