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目的:本实验采用体外重组技术,制备pcDNA3.1-HIF-1α质粒。将HIF-1α质粒经颈部颈外-颈内动脉途径注射入大脑中动脉缺血再灌注损伤的大鼠脑组织中,于6h、12h、24h、72h和7d时,取大鼠脑组织对神经胶质亚型细胞行特异性免疫组织化学染色,观察各组亚型细胞的变化。分别将HIF-1α、VEGF同胶质亚型细胞行荧光双染色,于激光共聚焦显微镜下观察共表达的情况。综合上述实验结果评价重组HIF-1α质粒对于脑梗死的治疗效果,及其对多种细胞修复重塑的调控机制。方法:1经体外获得的HIF-1α的cDNA,测序检测后克克隆入真核表达载体pcDNA3.1,酶切鉴定重组子2大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型制作参照Zea Longa等报道的方法并加以改进。10%水合氯醛腹腔麻醉,颈部正中切开,分离肌肉组织暴露颈部血管,经颈外动脉向颈内动脉插入线栓,线栓头端距血管分叉处1.8cm左右视为线栓梗死大脑中动脉。2h后取出线栓注入HIF-1α质粒,留取6h、12h、24h、72h和7d观察,对照组注入PBS;3将相应时间点实验组与对照组大鼠处死后断头取脑,视交叉后做2mm厚连续切片,第一片做TTC染色,其余做石蜡包埋,5μm厚连续石蜡切片,行HE染色并对各胶质亚型细胞行特异的免疫组织化学染色,高倍镜下分别计数不同时间点实验组和对照组各胶质亚型细胞的个数;4将石蜡切片分别对HIF-1α、VEGF同各胶质亚型细胞做免疫荧光双染色,于激光共聚焦显微镜下观察阳性细胞的重叠情况,分析胶质亚型细胞是否存在与HIF-1α、VEGF的表达;5统计学分析:使用SPSS15.0统计软件对实验数据进行统计学分析。组间计量资料比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义;结果:1 RT-PCR扩增HIF-1αcDNA,经测序结果与Genebank记载完全一致,构建并酶切鉴定后获得pcDNA3.1-HIF-1α质粒;2大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤后,经颈外动脉注射HIF-1α质粒组与PBS组死亡率未见明显差别,但是TTC染色见72h后,治疗组脑梗死面积明显小于对照组,而且存活7d大鼠神经功能缺失评分明显低于PBS对照组;3 HIF-1α对大鼠脑缺血再灌注后胶质亚型细胞的影响:大鼠脑缺血再灌注6h、12h、24h、72h和7d,经颈外动脉注射HIF-1α质粒组的星形胶质细胞(GFAP阳性细胞)数量均数分别为12.20±2.864、18.80±4.207、30.00±4.301、38.40±2.881和43.20±6.978,注射PBS组的数量均数为15.80±4.494、18.60±1.673、23.00±4.583、31.60±3.361和29.00±6.000,二者相同时间点阳性细胞均数做t检验比较,缺血再灌注损伤24h及以后各时间点,HIF-1α组与对照组阳性细胞数有差异(P<0.05);经颈动脉注射HIF-1α质粒后,小胶质细胞(Isolectin-B4阳性细胞)均数分别为8.400±2.074、14.40±4.393、20.80±2.280、17.00±3.162和11.60±2.408,PBS对照组阳性细胞均数为8.400±2.302、15.40±2.402、25.80±4.147、37.80±6.181和24.80±4.325,相同时间点两组阳性细胞均数做t检验比较,缺血再灌注损伤24h及以后各时间点两组间有差异,有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α注射组少突胶质细胞(CNPase阳性细胞)均数分别为17.00±2.916、11.40±2.302、10.00±3.526、16.40±2.302和19.20±2.388,PBS对照组阳性细胞均数分别为16.60±2.408、10.60±2.074、7.200±1.924、4.000±1.581和13.20±2.388,二者相同时间点阳性细胞均数做t检验比较,缺血再灌注损伤72h后,二组间阳性细胞数有统计学差异;4 HIF-1α、VEGF与胶质亚型细胞共表达:将石蜡切片行免疫荧光双染色,于激光共聚焦显微镜下观察,发现大量星形胶质细胞(GFAP阳性细胞)与HIF-1α、VEGF蛋白存在共表达情况,而未见小胶质细胞(Isolectin-B4阳性细胞)和少突胶质细胞(CNPase阳性细胞)中HIF-1α、VEGF明显表达。结论:1经颈外-颈内动脉注射重组pcDNA3.1-HIF-1α质粒可以有效的减少大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织的梗死面积。2大鼠脑缺血再灌注损伤后,经颈外-颈内动脉注射重组pcDNA3.1-HIF- 1α质粒可以促使星形胶质细胞增加,少突胶质细胞数量增加,并有效抑制小胶质细胞的增殖,起到神经保护作用。3大鼠脑缺血再灌注损伤后,各神经胶质亚型细胞中,HIF-1α蛋白主要在星形胶质细胞中表达。