丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)属于唇形科鼠尾草属多年生的药用模式植物,花瓣呈现紫色或者蓝紫色。白花丹参(Salvia miltiorrhiza Bge f.alba)是丹参一种白花变型。类黄酮次生代谢物质是植物各个组织呈色的主要化学基础,具有很强的抗氧化、清除活性氧、延缓衰老、抗癌、治疗和预防多种疾病等作用,还能保护植物抵御生物和非生物胁迫。目前,虽然类黄酮合成途径中的结构基因已经从丹参中被鉴定和分析,但是对它们的功能特性的研究鲜有报道。因此,本研究在比较分析类黄酮途径的关键酶基因在丹参和白花丹参时空差异表达模式的基础上,研究和探讨了丹参类黄酮生物合成途径的关键酶基因的功能,阐述丹参和白花丹参颜色表型差异的分子机制,探讨类黄酮和非类黄酮分支途径代谢流的交谈。本研究的主要内容如下:1.基于同源克隆和转录组数据库,从丹参花瓣中克隆得到了5个关键酶基因的ORF,分别命名为SmCHI、SmANS、SmF3H、SmF3’H和SmUF3GT。生物信息学分析表明,它们在进化上具有高度的保守性,与同属于唇形科植物的亲缘关系最近,参与调控花青素等类黄酮的生物合成与积累。2.qRT-PCR比较分析发现类黄酮生物合成相关基因(SmCHI、SmANS、SmF3H、SmF3’H、SmUF3GT、SmCHS、SmFNSⅡ、SmDFR、SmF3’5’H、SmDFR、SmPAP1、SmWD1和SmWD2)在丹参和白花丹参各个组织,以及在花发育进程中的各个花器官中的表达存在显著差异。SmANS在紫色沉淀的丹参花瓣、花萼和雌蕊中高表达,而在雄蕊中几乎不表达;在白花丹参的白色花瓣、绿色花萼、白色雌蕊中的几乎不表达,但是在含黄-蓝紫色相间的花粉雄蕊中特异性的高表达,表明SmANS是丹参和白花丹参花色差异的最为关键的因子。SmANS、SmF3’5’H和SmFNSⅡ在白花丹参的雄蕊中高表达,反而在紫花丹参的雄蕊中低表达,表明这三个基因的协同作用主导了白花丹参黄-蓝紫相间的花粉的呈色。SmF3’H在丹参和白花丹参的地上部分包括叶片、茎、花萼、花中的高表达特性,表明其与丹参地上部分大量类黄酮特别是二氢黄酮醇的积累相关;该基因在白花丹参的雄蕊中高表达,在紫花丹参的雌蕊和雄蕊中的极低水平的表达模式,表明SmF3’H也参与了白花丹参花粉的发育调控。这些基因与其它类黄酮基因(SmCHS、SmCHI、SmDFR和SmUF3GT等)表达效应的叠加决定了丹参和白花丹参各组织呈色。3.在丹参花发育中:SmCHS、SmCHI、SmF3H、SmF3’H、SmF3’5’H、SmPAP1、SmWD2、SmANS、SmFNSⅡ和SmUF3GT在未着紫色的幼蕾(F1)的表达量极其的低,随着紫色开始沉淀表现为先缓慢增长再快速增长的趋势,前7个基因在紫色花瓣全开的花(F4)的表达量达到了顶峰;而SmANS、SmFNSⅡ和SmUF3GT的表达在花全开放前的花(F3)中快速增加,却在F4期急剧下降;SmDFR的表达呈现渐进的增长趋势;SmWD1的表达在F1期最高,然后先急剧下降再回升再下降。在白花丹参的花发育中:SmCHS、SmCHI、SmDFR、SmUF3GT、SmF3’H、SmPAP1、SmANS在黄色幼蕾(F1)期的表达量最高,在中蕾(F2)期急剧下降然后到花开前期(F3)也保持下降趋势,前三个基因在白花盛开时表达量又稍有回升,而SmUF3GT和SmF3’H的表达始终保持下降的趋势;而SmANS的表达量在F3期有回升,在F4期再降低;SmF3H和SmF3’5’H和SmFNSⅡ的表达量在F1期极其的低,随着花发育在F3期表达量达到了顶峰,在F4期又降低,表明它们参与白花的花粉呈色;SmWD1和SmWD2的表达量在F1期极低,随花发育一直保持递增的趋势,暗示它们参与调控类黄酮的合成。以上结果揭示了类黄酮合成相关基因的协同表达调控着丹参和白花丹参的花瓣呈色,大部分类黄酮结构基因的低表达水平决定了白花丹参花瓣不能呈现紫色。4.利用烟草瞬转体系分析发现SmCHI、SmANS、SmUF3GT和SmF3‘H不仅定位于在烟草表皮细胞的高尔基体、质膜和细胞核上,而且SmCHI和SmF3‘H蛋白还定位于内质网、过氧化物酶体和质体上;SmANS也定位于内质网和质体上;SmUF3GT蛋白还定位于过氧化物酶体上;预测SmF3H定位于细胞质中。这种多亚细胞的定位模式表明SmF3‘H可能与其它类黄酮途径的关键酶相互作用形成多酶复合体,锚膜到内质网上,完成花青素等类黄酮的合成,转运和运输等。5.利用根癌农杆菌介导的植物转化体系分别获得了SmANS过表达的丹参和白花丹参转基因植株,以及SmANS沉默的丹参植株。SmANS过表达提高了丹参和白花丹参转基因植株中飞燕草氯化物的含量,新增了矢车菊二糖苷的合成和积累,同时显著上调了大部分类黄酮基因包括SmCHS、SmCHI、SmF3’H和SmDFR的表达;减少丹酚酸B和迷迭香酸的含量,同时显著下调了丹酚酸合成相关基因(SmPAL,SmC4H1,Sm4CL2,SmRAS和SmCYP98A14)的表达;改变了原花青素单体的合成积累。而SmANS-RNAi干扰降低了总花青素的合成,下调了除了SmDFR和SmF3H以外的大部分类黄酮基因的表达。而且SmANS过表达的丹参株系的叶片表面出现了明显的紫红色的着色,SmANS过表达的白花丹参转基因株系的茎节间和叶边缘恢复了紫红色的表型。揭示了SmANS不仅是丹参花色形成的关键因子,还在白花丹参花瓣颜色表型形成中扮演着―开关‖角色。该基因不仅控制花青素的合成积累,还能影响丹酚酸支路和原花青素支路的生物合成。6.为了研究SmF3’H的功能,获得了该基因的过表达和沉默的丹参转基因植株。SmF3’H的过表达改变了二氢槲皮素、二氢山奈酚和二氢杨梅素的合成比例,提高飞燕草色素和总花青素的含量,同时显著上调SmCHS、SmCHI、SmFNSⅡ、SmF3’5’H、SmDFR和SmANS的表达。沉默SmF3’H降低了飞燕草色素和总花青素的含量含量,降低大部分株系中3种二氢黄酮醇的含量,下调SmF3’5’H的表达。表明沉默SmF3’H改变了类黄酮的成分与积累,在丹参中与其它类黄酮合成途径上的基因协同表达。此外,过表达SmF3’H降低了总酚酸的含量,而沉默SmF3’H提高了总酚酸的含量,SmF3’H的过表达和沉默都能提高部分株系中丹酚酸B和迷迭香酸的含量。表明对类黄酮合成途径下游基因的分子调控,能引起类黄酮与丹酚酸支路的代谢流的crosstalk。揭示了位于类黄酮下游的基因对非类黄酮的丹酚酸途径也具有调控效应。