论文部分内容阅读
在阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnea, OSA）病人中，患有全身性高血压的比例很高。但OSA引起动脉压升高的机制仍未完全明确。有研究显示，OSA病人的交感神经活动增强，并且对OSA病人进行有效的鼻部持续性气道正压通气治疗（continuous positive airway pressure,CPAP）可以降低其交感神经活动和动脉压。此外，有研究发现循环性间歇性低氧（cyclic intermittent hypoxia, CIH）诱发啮齿类动物的动脉压升高，而且动脉压的升高需要持续的交感神经兴奋，因为CIH暴露前预先切断肾神经抑制动脉压的升高。这些结果说明持续的交感神经兴奋是OSA病人全身动脉压升高的关键因素。交感神经活动可以被外周反射活动和中枢交感处理过程影响。大量的研究显示：CIH暴露动物和OSA病人的外周化学反射敏感性增强，而化学敏感性增强有助于交感神经兴奋和高血压的发展。这些数据显示OSA造成的CIH增强病人的外周化学敏感性，但对CIH增强颈动脉体化学敏感性的机制的研究很少。大量的研究指出一氧化氮（nitric oxide, NO）是CIH增强颈动脉体化学敏感性的一种调质。生理浓度的NO对化学敏感性反应主要起抑制作用。NO主要由直接支配颈动脉体且胞体位于窦神经或舌咽神经内的神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）免疫阳性神经元合成并释放。有研究显示，慢性心衰家兔颈动脉体的nNOS表达减少，并且这种减少有助于增强化学敏感性。最近，有证据表明CIH降低大鼠颈动脉体nNOS的表达，但nNOS表达减少是否增强化学敏感性仍不清楚。本研究旨在观察CIH对大鼠颈动脉体及颈动脉体球细胞nNOS表达的影响和CIH对颈动脉体内NO抑制作用的影响，进而探讨CIH增强大鼠外周化学敏感性的机制。目的：利用CIH大鼠模型和CIH颈动脉体球细胞，观察CIH对大鼠颈动脉体及颈动脉体球细胞nNOS表达的影响和CIH对颈动脉体内NO抑制作用的影响。方法：1.雄性Sprague-Dawley大鼠，体重240-250g，购于河北医科大学实验动物中心，在空气湿度45%~55%，室温20℃~22℃的环境下饲养一周后，随机分成3组：空白对照组、常氧对照组和CIH组。将CIH组大鼠放置于间歇性低氧舱内，予以每天8h共35天的低氧暴露，程序设计为每一低氧复氧循环时间为4min，前1min充入100%N2使氧浓度降至8.2%~10%，后3min充入O2使氧浓度恢复到21%。常氧对照组大鼠放置于同样的低氧舱内，但是向舱内冲入空气而不是氮气和氧气。空白对照组放置于标准室内条件下饲养。喂养期间动物自由进食、饮水。35天后取各组大鼠进行检测：（1）大鼠股动脉插入导管，检测大鼠的股动脉压，观察CIH对大鼠动脉压的作用。（2）记录常氧条件下，基础的窦神经放电，观察CIH对大鼠基础窦神经放电的影响。（3）记录10%低氧条件下，常氧对照组和CIH组大鼠的低氧敏感性窦神经放电，观察CIH对颈动脉体化学敏感性的影响。（4）采用隔离灌流技术，向大鼠颈动脉体内分灌注nNOS抑制剂L-omega-nitro arginine （L-NNA0.3mg/kg）、 NO供体S-nitroso-N-acetylpenicillamine（SNAP30nmol/kg）和NO前体L-精氨酸（L-arginine100mg/kg），在10%低氧条件下记录常氧对照组和CIH组大鼠的窦神经放电，观察CIH对NO抑制作用的影响。（5）采用Western blot和RT-PCR技术,观察CIH对大鼠颈动脉体nNOS蛋白及nNOS mRNA表达的影响。2.将出生19-21天的SD大鼠的颈动脉体取出，用酶消化的方法得到颈动脉体球细胞，然后将细胞分别在常氧和CIH环境下培养，CIH程序设计为每一低氧复氧循环时间为60分钟，前35分钟向低氧培养室内冲入100%N2使氧浓度降至0.1%，后25min充入O2使氧浓度恢复到21%。培养期间CO2浓度一直维持在5%。培养箱温度维持在37°C。然后分别取对照组和CIH组培养6h、12h、24h和48h的球细胞进行免疫细胞化学检测，在显微镜下观察CIH对单个球细胞nNOS蛋白表达的影响。结果：1CIH对大鼠动脉压的影响与常氧对照组和空白对照组比较，CIH组大鼠股动脉压明显升高（n=6;常氧对照组91.5±2.8mmHg;空白对照组90.0±1.0mmHg; CIH组115.8±2.9mmHg; P <0.01）。2CIH对大鼠基础窦神经放电的影响与常氧对照组和空白对照组比较，CIH组大鼠的基础窦神经放电明显增强（n=6;常氧对照组24.2±1.1mV/s;空白对照组22.2±0.89mV/s;CIH组35.9±2.2mV/s; P <0.01）。3CIH对大鼠窦神经低氧敏感性放电的影响在10%低氧条件下，CIH组的窦神经放电与其基础放电的百分比明显大于常氧对照组（CIH组623.1±13.5%of baseline;常氧对照组485.6±18.0%of baseline; P <0.01）。4nNOS抑制剂L-NNA对大鼠窦神经低氧敏感性放电的影响颈动脉内注入nNOS抑制剂L-NNA明显的增加了两组大鼠10%低氧条件下的窦神经放电（CIH组699.1±15.6%of baseline, P <0.05;常氧对照组786.4±50.4%of baseline, P <0.01），但是对常氧对照组的影响明显大于CIH组（P <0.01）。5NO供体SNAP和NO前体L-arginine对大鼠窦神经低氧敏感性放电的影响颈动脉内注入NO供体SNAP（CIH组264.0±10.8%of baseline;常氧对照组340.0±9.2%of baseline）和NO前体L-arginine（CIH组390.2±15.6%of baseline;空白对照组238.2±7.7%of baseline）明显的降低了两组大鼠10%低氧条件下的窦神经放电，但是对CIH组的影响明显大于常氧对照组（P <0.01）。6CIH对颈动脉体nNOS蛋白及其mRNA表达的影响与常氧对照组比较，CIH组大鼠颈动脉体内的nNOS蛋白及nNOSmRNA表达均明显减少（P <0.005）。7CIH对颈动脉体球细胞nNOS蛋白表达的影响免疫细胞化学结果显示，与对照组比较，CIH组细胞的nNOS蛋白表达减少。结论：1.CIH通过降低大鼠颈动脉体内nNOSmRNA及蛋白的表达，增强颈动脉体的化学敏感性。2.CIH降低颈动脉体球细胞nNOS蛋白的表达。