论文部分内容阅读
实验目的:缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke)是一种由脑部的血液供应障碍所引起的局限性脑组织损伤的临床疾病,该病特征是大脑供血不足,脑组织缺氧缺糖,最终导致毁灭性和不可逆性的脑损伤。过氧亚硝酸离子(ONOO-)介导的线粒体自噬激活是缺血性脑卒中的重要致病机制。我们前期的研究表明,ONOO-介导Drp1募集到受损线粒体,导致线粒体过度线粒体吞噬,加重脑缺血再灌注损伤,而ONOO-介导的线粒体吞噬激活可能是改善缺血性脑卒中预后的重要治疗靶点。地黄作为中医临床常用药物,被广泛运用于脑卒中患者的医治和临床研究,地黄苦苷(Rehmapicroside,Reh)是地黄的有效单体成分之一,Reh对缺血性脑卒中的作用及其机制尚缺乏相关文献研究。因此,本实验采用采用氧葡萄糖联合剥夺/再灌注(oxygen and glucose deprivation and reoxygenation,OGD/RO)模型和大鼠大脑中动脉缺血(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注损伤模型,从抑制ONOO-介导线粒体自噬激活的角度,探究Reh对缺血性脑卒中的作用及其可能的机制,为缺血性脑卒中治疗药物的研究提供可靠的实验依据。实验方法:1、对PC12细胞进行2小时缺氧缺糖干预后,恢复氧糖条件诱发再灌注损伤。实验分组如下:空白对照组(Ctrl),ODG/RO模型组,ODG/RO+Reh 25 μ M组(Reh 25),ODG/RO+Reh 50 μM组(Reh 50),ODG/RO+Reh 100 μ M组(Reh 100)。再灌注期间,各剂量Reh组给予相应浓度的受试药物Reh。对诱发缺氧缺糖损伤的PC12细胞进行MTT实验,Werstern Blot检测线粒体自噬和凋亡相关蛋白,Het和HK Yellow-AM染色等实验。2、运用UPLC系统评估Reh与ONOO-直接作用。样品分组如下:分为Reh 500μM对照组、Reh 500 μM+ONOO-1mM 组与 Reh 500 μM+ONOO-4mM 组。所有分析物的储存液用甲醇制备,各组取100 μL样品至UPLC系统中。3、对雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠进行MCAO手术,致使大脑中动脉缺血2小时再灌注22小时的损伤。动物分组如下:假手术对照组(Sham)、MCAO模型组(MCAO)、MCAO+Reh 2.5mg/kg 组(Reh-2.5mg)、MCAO+Reh 5mg/kg 组(Reh-5mg)、MCAO+Reh 1Omg/kg组(Reh-10mg)和MCAO+PDC 3mg/kg组(PDC)。再灌注开始时,各组分别经腹腔注射相应剂量的受试药物,Sham组与MCAO组则腹腔注射等体积的溶剂(生理盐水)。4、于缺血2小时再灌注22小时后,对SD大鼠进行mNSS神经功能评分;采用TTC染色法观察梗死面积;采用Western Blot、线粒体分离实验、免疫沉淀法检测缺血再灌注损伤脑侧的蛋白表达情况;采用免疫荧光化学染色法检测线粒体自噬、Drp1硝基化的生物学情况。实验结果:(1)Reh能够直接清除ONOO-;(2)Reh能够降低OGD/RO损伤的PC12细胞中O2-和ONOO-的表达,上调 Bcl-2,下调 bax、caspase-3 和 cleaved caspase-3,下调 PINK1、Parkin、SQSTM1/p62,降低LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的比例;(3)Reh可以抑制缺血再灌注大鼠大脑中3-NT的形成、Drp1硝基化、NADPH氧化酶与iNOS的表达;(4)Reh可以阻止缺血再灌注大鼠大脑中PINK1、Parkin和Drp1向线粒体的转位,进而抑制线粒体自噬的激活;(5)Reh改善了 MCAO所致缺血再灌注损伤大鼠的梗死面积和神经功能缺损评分。实验结论:实验结果显示Reh对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用,其潜在的神经保护机制可能是通过抑制ONOO-介导的线粒体自噬激活,Reh可作为对抗脑缺血再灌注损伤的潜在候选药物,具有进一步开发研究的价值。