论文部分内容阅读
膜联蛋白A2(AnnexinA2,ANXA2)是属于钙依赖性膜磷脂联结蛋白家族中的一员,在动物的多种组织与细胞内广泛存在,主要参与细胞生长、增殖、凋亡、囊泡运输、离子通道、细胞骨架形成等功能。研究表明,鸡卵泡膜细胞不仅能分泌雌激素,还能调控卵泡膜细胞中ANXA2的表达,并且卵泡膜中ANXA2基因的表达上调与卵泡发育密切相关。为探索ANXA2在鸡卵泡膜中发挥的作用,本研究首先对鸡ANXA2基因进行克隆和生物信息分析,通过构建鸡ANXA2基因重组原核载体,进行重组蛋白His-ANXA2的原核表达和纯化,同时利用His pull-down和质谱技术从鸡卵泡膜细胞中筛选与鸡ANXA2相互作用的细胞蛋白。1鸡ANXA2基因的克隆与生物信息学分析通过RT-PCR从鸡卵泡膜细胞中扩增ANXA2基因CDS区,将其亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)构建重组原核表达载体pET-32a-ANXA2,并运用生物信息学软件对鸡ANXA2进行生物信息学分析。结果显示,鸡ANXA2基因编码区全长为1020 bp,共编码339个氨基酸,理论pI为6.92,分子量约为38.6 Ku。鸡ANXA2蛋白具有丰富的二级结构,以α-螺旋和无规则卷曲为主;此蛋白功有2个结构域,分别为1个可变的氨基端端功能域和1个保守的羧基端核心区功能域,但鸡与鹌鹑中的功能结构域氨基端位点与人和哺乳动物不相同。遗传进化分析发现:鸡和火鸡的亲缘关系最近(核苷酸同源性为98.1%)。STRING软件预测与ANXA2蛋白互作的蛋白有10种,主要分布在胞质中,参与纤维蛋白溶解、免疫系统、信号传导等功能。2鸡ANXA2基因的原核表达与重组蛋白纯化本研究将成功构建的鸡ANXA2基因重组原核表达载体pET-32a-ANXA2转化到大肠杆菌BL21(DE3),分别用不同浓度梯度IPTG(0.1、0.5、1.0和1.5mmoL/L)、不同诱导温度(25、30和37℃)、不同诱导时间(2、3、4和5 h)对重组蛋白表达条件进行优化,并分析重组蛋白的表达形式。结果表明:重组蛋白His-ANXA2,诱导重组大肠杆菌在温度30℃、IPTG浓度为0.1 mmoL/L、诱导时间5h时表达量高,其在上清和包涵体中均有表达重组蛋白,但主要以包涵体形式存在。进一步用HisPur Ni-NTA Magnetic Beads琼脂球对上清中的重组蛋白进行纯化,并运用Western blotting方法进行鉴定。结果显示:从诱导菌裂解物上清中得到了纯度较高的重组蛋白,Western blotting检测在蛋白分子量约为53 Ku处蛋白的条带与预期大小相符的重组蛋白条带相符。3鸡卵泡膜细胞中与ANXA2相互作用细胞蛋白筛选的及功能分析以重组蛋白His-ANXA2为诱饵蛋白,以标签蛋白His作为对照,将制备的原代鸡卵泡膜细胞提取全蛋白,利用His Pull-down技术从鸡卵泡膜细胞蛋白中钓取与His-ANXA2和His相互作用的蛋白,通过液相色谱串联质谱LC-MS/MS鉴定与重组蛋白His-ANXA2和标签蛋白His相互作用的细胞蛋白。结果表明,共鉴定到87个蛋白,其中仅与His-ANXA2互作的蛋白为41个,与His标签蛋白互作的蛋白为14个。将与His-ANXA2互作的41个蛋白进行GO功能注释、KEGG信号通路分析和蛋白互作网络图进行分析。结果显示,鉴定的互作蛋白主要分布在细胞膜和细胞骨架,参与了细胞骨架形成、应对刺激和翻译等生物学过程,而分子功能主要表现在结合、催化活性和核糖体结构形成等方面。KEGG信号通路分析显示,互作的蛋白主要参与压力应答、代谢、翻译、信号转导、免疫以及蛋白质定位等通路。蛋白质互作网络图分析显示,蛋白之间存在复杂的互相作用。以上实验结论为深化研究ANXA2参与鸡卵泡发育的作用机制奠定基础。