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目的:研究蛴螬提取物对人宫颈癌HeLa细胞株的抑制增殖及诱导凋亡作用,并探讨其作用机制,为新药开发提供实验和理论依据。
方法:应用MTT法检测蛴螬提取物对体外培养的人宫颈癌HeLa细胞株的抑制增殖作用的影响及细胞毒活性;通过倒置显微镜、HE染色、油红“O”染色法、透射电镜的方法观察肿瘤细胞的形态学改变;应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧核苷酸缺口末端标记(TdT-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)法检测蛴螬提取物对细胞诱导凋亡的情况;采用流式细胞仪检测HeLa细胞的细胞周期分布相和细胞凋亡率;通过免疫细胞化学S-P法测定凋亡关键效应酶Caspase-8和Caspase-3与凋亡相关基因产物p53、bcl-2、Bax、Fas蛋白的表达情况,深入探讨蛴螬提取物对人宫颈癌HeLa细胞株诱导凋亡的机制。
结果:(1)MTT比色法结果表明:蛴螬乙酸乙酯、氯仿和石油醚三种提取物中以石油醚提取物增殖抑制效果最佳。蛴螬石油醚提取物对人宫颈癌HeLa细胞株的增殖抑制作用呈剂量依赖性(P<0.01),同时呈时间依赖性(P<0.01);(2)倒置显微镜观察:蛴螬石油醚提取物50μg/ml作用后早期细胞出现凋亡形态学变化细胞膜鼓泡、凋亡小体形成等;作用晚期细胞发生膜破裂坏死;(3)HE染色:蛴螬石油醚提取物50μg/ml作用细胞后出现典型凋亡形态变化凋亡小体形成、细胞核浓缩呈蓝黑色、胞浆呈淡红色等,核染色质浓缩、呈碎块状;(4)油红“O”染色观察蛴螬石油醚提取物50μg/ml作用细胞后胞浆中存在大小不等的红色圆形脂肪滴围绕在核周出现;(5)透射电镜观察结果:蛴螬石油醚提取物50μg/ml作用细胞后出现核染色质致密浓缩或断裂,形成大小不等的凋亡小体;部分细胞胞浆内出现脂滴储积,细胞发生脂肪变性;(6)TUNEL法检测结果:蛴螬石油醚提取物作用细胞后凋亡细胞数目随时间延长而增多;加药组凋亡率与对照组相比有显著性差异(P<0.01),同时凋亡指数呈时间依赖性和剂量依赖性;(7)流式细胞仪检测结果显示:蛴螬提取物可以诱导HeLa细胞发生凋亡,加药组出现亚二倍体峰,并且Go/G1期细胞比例显著增加(P<0.01),而S期和G2/M期细胞比例则明显下降,将细胞阻滞在Go/G1期;(8)免疫细胞化学结果表明:蛴螬石油醚提取物作用后加药组Caspase-8和Caspase-3表达增加,p53、bcl-2蛋白随提取物浓度表达均降低,Bax和Fas蛋白表达增加,与对照组相比较均有显著差异(P<0.01)。
结论:
1、蛴螬乙酸乙酯、氯仿和石油醚三种提取物对人宫颈癌HeLa细胞株具有抑制增殖及诱导凋亡作用,其中以石油醚提取物增殖抑制作用效果最佳。
2、蛴螬石油醚提取物对HeLa细胞抑制增殖作用在粗提物50μg/ml作用48h之前主要以诱导凋亡为主,在其后时间以诱发肿瘤细胞脂肪变性和坏死为主。
3、蛴螬石油醚提取物诱导凋亡作用机制可能与细胞周期发生Go/G1期阻滞有关;并且通过下调p53、bcl-2蛋白表达,上调Bax、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达,经由细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路完成凋亡的启动和执行。
4、蛴螬石油醚提取物具有显著的抑肿瘤作用,有望开发成一种新的抗肿瘤药物。