论文部分内容阅读
目的：本实验以人大肠腺癌SW620细胞株为研究对象,在细胞水平上,探讨重组质粒hARDl-shRNA对5--Fu诱导人大肠腺癌细胞凋亡的影响,从而为靶向分子治疗、靶向分子治疗联合化疗治疗大肠癌、研究影响化疗敏感性因子提供一些实验依据,为后续hARD1的深入研究提供基础。方法：1、人大肠腺癌细胞株SW620、shCON-SW620、hARD 1-shRNA-SW620的培养。2、稳定转染细胞系pENTRTM/U6-hARDl-shRNA-SW620的转染率检测。实验分组：实验组：hARDl-shRNA稳定转染SW620细胞。阴性对照组：空载质粒转染SW620细胞。空白对照组：SW620细胞3、MTT法分别检测三个实验组对5-Fu敏感性的影响4、流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞早期凋亡5、流式细胞术PI单染法检测细胞周期的变化6、Western blot检测5-Fu作用后的大肠腺癌组织中]hARDl蛋白表达7, Q-PCR检测5-Fu作用后的大肠腺癌组织中hARDl mRNA的表达结果：1、人大肠腺癌细胞株SW620、shCON-SW620、hARDl-shRNA-SW620的培养。体外培养成功且生长状态良好。2、pENTRTM/U6-hARDl-shRNA-SW620稳定转染细胞系稳定性和转染率检测：shRNA-ARDl SW620培养48h后对hARDl mRNA表达抑制率达54.8%。3、MTT法检测三个实验组对5-Fu敏感性的影响：分别用不同浓度5-Fu(0、1,、10、20、40、100、500、1000μg/ml)处理各组细胞观察各时间段(0、12、24、48、72h)细胞的生长,测吸光光度值(OD值),计算肿瘤细胞抑制率及IC50。SPSS20.0统计软件处理,单因素方差分析结果显示：瘤细胞抑制率及IC50实验组与阴性组、实验组与空白组比较有统计学意义(P<0.05)；空白组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。半数抑制浓度(IC50)分别为：实验组344.953±28.539μg/ml,阴性组798.383±86.59μg/ml,空白组735.338±36.530μg/ml4、流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞早期凋亡：无药物处理的三组细胞凋亡率比较：实验组、阴性对照组、空白组无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05)。低浓度5-Fu(100μg/ml)处理后细胞凋亡率比较：实验组较空白组和阴性组细胞凋亡率增加,有统计学差异；高浓度5-Fu(500μg/ml)处理后,细胞凋亡率比较：实验组较空白组和阴性组细胞凋亡率增加,有统计学差异(P<0.05),空白组与阴性组比较无统计学意义(P>0.05)。5、流式细胞术PI单染法检测细胞周期的变化：在5-Fu无药物作用下,实验组的G0/G1期细胞比例较阴性组、空白组高(p<0.05)。低浓度(100ug/m1)的作用后各组细胞的GO/G1期细胞比例增高,其中实验组G0/G1期的细胞比例较阴性组和空白组低高(p<0.05)。在5-Fu高浓度(500ug/m1)作用下出现Sub-Gl峰,实验组G0/G1期细胞较无药物组下降(p<0.05),但实验组与阴性对照组和空白对照组无统计学差异(p>0.05),其细胞比例较低浓度及无药物作用组明显增高(p<0.05)。出现Sub-Gl峰,此为亚G1峰,其出现Sub-Gl期细胞比例较无5-Fu处理和低浓度5-Fu处理时增高,实验组增高程度较阴性组和空白组高,差异具有统计学意义p<0.05)。6、Western blot检测5-Fu作用后的大肠腺癌细胞中hARD1蛋白表达：对三组细胞中hARDl蛋白相对表达量进行灰度值分析,结果表明：实验组与对照组两两对比差异有统计学意义(P<0.05)；空白组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。7、Q-PCR检测5-Fu作用后的大肠腺癌细胞中hARDl mRNA的表达的结果表明：hARDl mRNA表达水平,实验组与阴性组、实验组与空白组比较有统计学意义(P<0.05),空白组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1. shRNA沉默ARD1基因能提高5-Fu在大肠腺癌SW620细胞中治疗的敏感性,具有化疗增敏作用。2. shRNA沉默hARD1基因能促进由化疗药物5-Fu引起的大肠癌SW620细胞的凋亡。3. shRNA沉默ARD1基因联合低浓度5-Fu使大肠癌SW620细胞周期阻滞在G0/G1期,联合高浓度5-Fu则促进细胞凋亡。4. shRNA沉默ARD1基因联合5-Fu可下调大肠腺癌细胞中hARDl蛋白的表达水平。5. shRNA沉默ARD1基因联合5-Fu可下调大肠腺癌细胞中hARDlmRNA表达水平