【摘 要】
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）,是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染而造成的急性传染病。2018年夏末秋初,该病首次传至我国,并且迅速在全国各地爆发。目前疫苗的研制仍然是个较大的难题,所以针对非洲猪瘟的防控,高效、快速和灵敏的临床诊断方法极为重要。P30蛋白是非洲猪瘟病毒早期表达的一种结构蛋白,适用于早期诊断。为了非洲猪瘟
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）,是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染而造成的急性传染病。2018年夏末秋初,该病首次传至我国,并且迅速在全国各地爆发。目前疫苗的研制仍然是个较大的难题,所以针对非洲猪瘟的防控,高效、快速和灵敏的临床诊断方法极为重要。P30蛋白是非洲猪瘟病毒早期表达的一种结构蛋白,适用于早期诊断。为了非洲猪瘟疫病的早发现、早诊断和早清除,本研究通过构建表达载体p ET-28a-P30,利用原核表达系统,表达非洲猪瘟P30重组蛋白,建立非洲猪瘟间接ELISA抗体检测方法,进行以下试验。1、非洲猪瘟病毒P30蛋白的原核表达与纯化根据Gen Bank公布的ASFV China/2018/Anhui毒株的CP204L基因序列,人工合成目的片段并无缝克隆至表达载体p ET-28a（+）中,经过转化至BL21菌株后,通过IPTG诱导表达非洲猪瘟P30蛋白。2、ASFV间接ELISA抗体检测方法的建立将纯化后的重组蛋白P30作为包被抗原,通过单一变量法对ELISA各反应条件进行优化,确定最适包被浓度、血清稀释倍数、封闭液、酶标二抗稀释倍数、血清孵育时间、二抗反应时间和底物显色时间。3、ASFV间接ELISA抗体检测方法的质量评价及应用将建立的间接ELISA检测方法进行特异性、敏感性、重复性、符合率和保质期试验,并应用所建立的非洲猪瘟病毒间接ELISA检测方法进行临床应用。经过试验后,研究最终取得以下结果:1、成功得到目的蛋白P30,该蛋白在本研究的表达条件下部分可溶。纯化后,SDS-PAGE显示获得大小约为23.1 k Da的单一目的条带,纯度较高。2、抗原最佳包被浓度为0.5μg/m L,血清稀释倍数为1:40、封闭液为5%脱脂奶粉、酶标二抗工作浓度为1:8 000、血清孵育时间和二抗反应时间均为30 min、底物显色时间为10 min,确定该方法的阴阳性临界OD630值为0.238。3、该检测方法与多种疫病阳性血清无交叉反应,说明特异性良好;当ASF阳性血清样本稀释至1:10 240时,结果仍呈阳性,说明其敏感性良好;批间重复性与批内重复性试验结果变异系数均在10%以下;试剂盒在4保存时,至少在3个月内有较高的一致性;与商品化试剂盒相比较,总符合率达到100%;应用该方法对170份血清样本进行了检测,结果显示其中阳性43份,阴性127份。综上所述,本研究成功利用表达的重组P30蛋白建立起了ASFV间接ELISA抗体检测方法,特异性、敏感性和符合性都良好,达到了预期效果。
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