乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一,是威胁女性健康的一大杀手。乳腺癌的发生与生活习惯密切相关。在欧美国家,乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤首位。在中国,随着人们生活水平的不断提高以及生活方式的改变,乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势,预计2020年我国乳腺癌患者将高达250万人,且患者逐渐趋于年轻化。尽管近年来医疗水平不断提高,对乳腺癌发病机制研究也取得了很大的进展,但是其高发病率、低生存率的特点尚未得到良好的改善。术后复发和远端转移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因。上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是使肿瘤细胞获得侵袭转移能力的重要因素,指上皮细胞经过特定的程序失去上皮表型,转化为间充质细胞的过程。上皮-间质转化与多种生物学进程相关。上皮-间质转化可以促进肿瘤恶性表型转化的发生,是诱发乳腺癌细胞突破细胞外基质及血管基底膜进入循环系统,进而发生侵袭迁移,形成远处继发性转移灶的重要原因。因此,寻找参与调节乳腺癌细胞上皮-间质转化的相关分子,将为未来乳腺癌的研究与治疗提供新的思路和靶点。干细胞(Stem Cells,SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,在特定条件下可以分化形成多种功能的细胞。有研究表明,正常干细胞的调控异常会导致其发生异常扩增,进而增加了肿瘤的易感性,被认为是肿瘤干细胞的来源之一。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSC)是1983年Mackillop提出的,他认为在肿瘤中可能存在一部分具有自我更新能力、可以分化为其他类型肿瘤并启动肿瘤形成的细胞,即肿瘤干细胞。越来越多的研究证实,肿瘤干细胞在维持肿瘤的恶性增殖、侵袭、转移、复发等多个方面起着决定性的作用。Sirtuin4(SIRT4)是Sirtuins蛋白家族的重要成员。Sirtuins蛋白家族是一类高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nieotinamide Adenie Diueleotide,NAD+)依赖的去乙酰化酶类(Histonedeacetylase,HDAC),该家族包括7个成员SIRT1-SIRT7,参与调控了多种生物学进程,并与许多疾病的发生发展密切相关。SIRT4与该家族其他成员不同,已有研究表明,SIRT4虽然包含保守的脱乙酰酶结构域,但是并没有脱乙酰酶活性,只具有ADP-核糖基转移酶活性,参与调控细胞内多种营养物质的分解代谢,例如:谷氨酰胺代谢、糖代谢、脂质代谢等。SIRT4可以通过调节谷氨酰胺分解代谢进而实现其对细胞内能量代谢的调控作用。已有研究表明SIRT4可以抑制包括肝癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等在内的多种癌症发生发展,但其是否对乳腺癌的发生发展具有调控作用,目前还尚未有系统的报道。本课题主要探讨了 SIRT4对乳腺癌细胞上皮-间质转化以及侵袭转移的调控作用,并发现了其对乳腺癌细胞的干性也具有十分重要的调节作用,研究内容可以分为以下三个部分:(一)SIRT4在乳腺癌组织中的临床意义研究:应用生物信息学分析技术,在TCGA数据库和GEO数据库中分析SIRT4表达水平与乳腺癌患者恶性程度之间的相关性,并利用Kaplan-Meier方法在TCGA数据库中分析SIRT4的表达水平是否与患者生存预后有关,初步明确SIRT4对乳腺癌的发生发展具有调控作用;应用包含正常乳腺组织、原位癌组织及具有转移特性的乳腺癌组织的乳腺组织芯片,通过免疫组织化学染色实验检测SIRT4的表达情况,进一步验证SIRT4的表达水平与乳腺癌肿瘤转移相关;(二)SIRT4抑制乳腺癌细胞EMT以及侵袭迁移作用的研究:在实验室现有的四种乳腺癌细胞系(MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF7、BT549)以及一种正常乳腺上皮细胞系(MCF10A)中,综合应用qRT-PCR、Western blot等实验技术,检测目标分子SIRT4的基础表达情况,并根据检测结果,应用慢病毒转染技术,分别构建SIRT4稳定过表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SIRT4稳定敲低的乳腺癌细胞系MCF7,及其相应对照组细胞系。在构建成功的细胞系中应用MTT、克隆形成,Western blot、免疫组织化学染色、Transwell、Matrigel、细胞划痕以及裸鼠体内成瘤等实验技术明确SIRT4对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移以及EMT的影响;(三)SIRT4调控乳腺癌细胞干性的研究:应用RNA-seq实验技术证实SIRT4表达量的降低会导致乳腺癌干细胞相关标志基因的表达以及相关信号通路的改变。并通过Western Blot、qRT-PCR证实SP细胞与乳腺癌干细胞中SIRT4的表达量显著低于非SP细胞以及正常乳腺癌细胞;此外流式细胞实验、Sphere Formation实验等也进一步表明SIRT4表达量的改变可以影响乳腺癌干细胞的形成。本课题的顺利进行,有望揭示乳腺癌转移复发的新机制,明确SIRT4在乳腺癌发生转移中具体作用及其临床意义,为乳腺癌的诊断和治疗提供新的思路与靶点。