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第一部分CXCL12-CXCR4在头颈部鳞状细胞癌的表达与淋巴结转移的关系目的观察趋化因子CXCL12及其受体CXCR4在头颈部鳞癌(head andneck squamous carcinoma,HNSCC)组织及颈部淋巴结中的表达情况,分析CXCL12、CXCR4的表达与头颈鳞癌临床、病理的关系,探讨CXCL12-CXCR4生物轴在头颈鳞癌淋巴结转移中的作用。方法总结2005-2006年于天津肿瘤医院头颈科手术切除及活检的65例具有完整临床病理资料的头颈部鳞癌标本特点,以正常口腔黏膜组织及良性肿瘤15例作为对照,用免疫组织化学染色及RT-PCR方法检测CXCL12、CXCR4在各组中的表达情况,观察不同组别CXCL12、CXCR4的表达区别及其与HNSCC临床生物学行为——主要是淋巴结转移——的关系。结果头颈鳞癌患者CXCR4免疫组化阳性率:Ⅰ-Ⅱ期为26.9%(7/26),Ⅲ-Ⅳ期为71.8%(28/39),差异有显著性(P＜0.01);鳞癌高、中分化者阳性率为42.6%(20/47),低分化为83.3%(15/18),差别有显著性差异(P＜0.01);有淋巴结转移组阳性率71.4%(25/35),无转移组阳性率为33.3%(10/30),正常对照组表达极低,差别有显著性差异(P＜0.05)。原发灶CXCL12的阳性率在所有临床、病理参数分组的表达高低均无统计学差异(P＞0.05),在良性及正常组织对照中为低表达。RT-PCR结果:发生转移组中CXCR4表达明显高于非转移组及对照组(P＜0.05);而未转移组CXCR4表达高于良性对照组表达(P＜0.05)。有转移瘤组织的淋巴结CXCR4的表达明显高于无转移组织的淋巴结(P＜0.05),而两组淋巴结中CXCL12的表达无显著性差异(P＞0.05)。结论趋化因子CXCL12在转移靶器官(淋巴结)的表达明显高于非靶器官(脂肪)的表达;趋化因子受体CXCR4的高表达与口腔鳞状细胞癌发生淋巴结转移及临床分期密切相关。CXCR4表达高低可能会影响CXCL12的趋化作用,验证了CXCL12-CXCR4生物轴能够促进HNSCC向颈淋巴结的定向转移。第二部分CXCL12-KDEL融合基因的构建与鉴定及其“胞内捕获”CXCR4抗CXCL12-CXCR4趋化口腔鳞癌转移的实验研究目的构建内质网滞留序列KDEL及趋化因子CXCL12的融合基因CXCL12-KDEL(带有E-tag标签),克隆入pIRES2-EGFP真核表达载体。融合基因CXCL12-KDEL转染人高转移口腔鳞状细胞癌细胞系Tb3.1,抑制CXCR4在细胞膜表达,从而阻断CXCL12-CXCR4生物轴,观察对肿瘤细胞的趋化作用的影响。方法在GenBank检索人CXCL12基因编码序列,确定扩增区域,设计引物并加入KDEL序列。取口腔鳞癌的颈部转移淋巴结,以Trizol提取总RNA,使用RT-PCR方法获得CXCL12-KDEL融合基因的编码序列,克隆入pMD19-T载体。测序鉴定后亚克隆至pIRES2-EGFP真核表达载体中,并再次测序验证。使用脂质体将CXCL12-KDEL真核表达载体转染至高转移人口腔鳞状细胞癌细胞系Tb3.1,观察转染效率(实验组)。同时以转染空载体pIRES2-EGFP组和未转染细胞组作为对照组,进行以下功能试验:Western blot实验检测转染融合基因后的癌细胞中带有E-tag标签的CXCL12的蛋白表达;流式细胞仪检测转染后细胞膜CXCR4蛋白表达;Chemotaxis chamber细胞趋化实验检测转染后鳞癌细胞对CXCL12的趋化、迁移能力。对比实验组与对照组的差异。结果经测序证实,正确构建了人CXCL12-KDEL融合基因,并克隆入真核载体pIRES2-EGFP,获得CXCL12-KDEL-pIRES2-EGFP重组载体。脂质体转染CXCL12-KDEL-pIRES2-EGFP至鳞癌细胞系Tb3.1,72h效率最高,达50%以上。Western blot检测证实实验组转染细胞有E-tag标记的CXCL12蛋白表达,而两对照组及三种细胞上清中均无E-tag标记的CXCL12蛋白表达。转染后实验组细胞膜CXCR4表达明显较对照组降低。转染CXCL12-KDEL组、pIRES2-EGFP组及未转染组受CXCL12趋化迁移的鳞癌细胞数分别为216.00±84.12,711.33±49.54,825.67±62.80,转染CXCL12-KDEL细胞趋化较两对照组明显减少。结论成功构建了表达CXCL12-KDEL融合基因的真核表达载体。CXCL12-KDEL基因转染后,由于内质网滞留作用,鳞癌细胞膜表达CXCR4被抑制,阻断了CXCL12-CXCR4生物轴对鳞癌细胞的趋化、转移作用;CXCL12-CXCR4生物轴是促进头颈部鳞癌转移的重要因素。