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研究目的再生障碍性贫血（Aplastic Anemia,AA）的发生发展与免疫功能失调引起的T淋巴细胞功能异常亢进密切相关,T淋巴细胞功能亢进与AA患者自身骨髓微环境内骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSCs）功能缺陷有关。T淋巴细胞亚群功能失衡是导致AA异常免疫反应的重要原因,Th1、Th2、Th17以及Treg平衡失调参与AA发生发展的病理过程。研究表明TGF-β/Smad信号的激活可能参与调节包括Th1,Th2,Th17和Treg等T淋巴细胞功能分化。有临床研究报道AA患者外周血中TGF-β含量下降,经MSCs免疫治疗能提高TGF-β表达量。本课题组在前期研究中证实正常人骨髓间充质干细胞（Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,hBMSCs）输注可增加 AA患者外周血中Treg细胞数量,减少Th1细胞比例,说明hBMSCs可能通过调控免疫系统中T淋巴细胞亚群发挥免疫调控作用。本实验通过在体外建立hBMSCs与PHA刺激的外周血CD4+T淋巴细胞（CD4+T）共培养体系的方法,证实正常来源hBMSCs通过调控T细胞亚群分化发挥免疫调节作用,并将TGF-β/Smad通路特异性抑制剂SB525334加入共培养体系,拟分别在细胞分子、蛋白及基因水平上探讨TGF-β/Smad信号通路在正常hBMSCs调节T淋巴细胞亚群的作用机制。实验方法（1）分离AA患者外周血单个核细胞悬液,应用人CD4+MicroBeads免疫磁珠分离CD4+T淋巴细胞。（2）将正常hBMSCs与经免疫磁珠分选的CD4+T淋巴细胞共培养72小时,将hBMSCs对外周血CD4+T淋巴细胞免疫功能的调节研究分为对照组（CD4+T）、实验组 1（hBMSCs+CD4+T）和实验组 2（hBMSCs+CD4+T+SB525334）。（3）采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组共培养体系中TGF-β、IL-2、IL-10、IL-17、TNF-α 及 IFN-y 含量。（4）采用流式细胞术（FCM）检测各组共培养体系中Th1,Th2,Treg和Th17等T细胞功能亚群的比例。（5）采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组CD4+T淋巴细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白mRNA的表达水平。（6）采用蛋白质免疫印迹技术（Western blot）检测各组共培养体系中CD4+T淋巴细胞中TGF-β/Smad通路相关蛋白的表达水平。实验结果（1）ELISA检测结果显示,相比较CD4+T组,hBMSCs+CD4+T组上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-17 含量明显下降（P＜0.05）,IL-10、TGF-β 含量较 CD4+T组明显升高（P＜0.05）;与hBMSCs+CD4+T培养体系相比,加入抑制剂SB525334（hBMSCs+CD4+T+SB525334）后共培养体系上清中 IFN-γ、TNF-α、IL-17 浓度稍升高（P 分别为 0.10、0.125、0.159）,IL-2 明显升高（P＜0.05）,TGF-β 含量稍下降（P=0.141）,IL-10明显下降（P＜0.05）。（2）流式细胞术检测结果显示,与CD4+T组相比,hBMSCs+CD4+T培养体系中Th2、Tregs 比例上升,Th1、Th17比例下降（P＜0.05或＜0.001）;加入抑制剂 SB525334 后 Th2、Tregs 比例较 hBMSCs+CD4+T 组下降（P＜0.05 或＜0.001）,但仍高于 CD4+T 组;Th1、Th17 比例较 hBMSCs+CD4+T组上升（P＜0.05或＜0.001）,但仍低于CD4+T组。（3）RT-PCR检测结果显示,相比较CD4+T组,加入hBMSCs（hBMSCs+CD4+T组）能使共培养体系内 TGF-β、Smad2、Smad3、GATA-3、FOXP3mRNA表达水平显著上升（P＜0.05）,同时使T-bet、RORγtmRNA表达明显下降（P＜0.05）。而与hBMSCs+CD4+T组相比,加入抑制剂SB525334（hBMSCs+CD4+T+SB525334 组）明显下调了 TGF-β、Smad2、Smad3、FOXP3mRNA 的表达（P＜0.05）,GATA-3mRNA 的表达稍有下降（P=0.403）,但是显著上调了 T-bet、RORytmRNA表达水平（P＜0.05）。（4）Western blot 检测结果显示,相比较 CD4+T 组,hBMSCs+CD4+T 组 TGF-β通路相关蛋白 TGF-β、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、GATA3、Foxp3 蛋白表达量明显升高（P＜0.05或＜0.001）,Smad2蛋白表达量呈升高趋势但组间无明显统计学差异（P=0.082）;T-bet、RORγ t蛋白表达量则明显下降（P＜0.05或＜0.001）。经给予SB525334干预后能明显逆转上述蛋白的表达,相比较hBMSCs+CD4+T组,TGF-β、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、FOXP3 的表达均明显降低（P＜0.05）,Smad2、GATA-3的表达虽有所下降,但组间缺少统计学差异（P分别为0.110和0.091）。同时T-bet、RORyt表达明显上升（P＜0.05）表明BMSCs可能通过TGF-β/Smad通路发挥调节T淋巴细胞亚群的作用。实验结论（1）AA患者自身骨髓微环境中的MSCs在调节Th1,Th2,Treg和Th17等T细胞亚群分化上可能存在功能缺陷。（2）正常hBMSCs可能通过TGF-β/Smad信号通路减少血清IFN-γ、TN-α、IL-2、IL-17表达,上调IL-4、IL-10表达,抑制T细胞向Th1、Th17细胞分化,促进T细胞向Treg细胞分化,调控Treg/Th17平衡而发挥免疫调节作用。