叶片衰老是植物生长发育最后一个阶段,受到基因的严格调控和内外部环境因素诱导。WHIRLY(WHY)转录因子家族是一类广泛存在于植物中能够与ssDNA结合的蛋白家族。在模式植物拟南芥中包含三个成员,I型的AtWHY1和AtWHY3蛋白和Ⅱ型的AtWHY2蛋白。其中WHY1已经被证实定位于叶绿体和细胞核中,并且可能参与植物的逆向信号转导调控植物叶片衰老的过程,但是其作用机制并不明确,目前对WHY蛋白功能的报道也大多都是基于转录水平上研究。本课题基于前期研究结果,CIPK14磷酸化WHY1蛋白,改变WHY1蛋白在质体和核的分布,而且过表达CIPK14与双敲除WHY1和WHY3植株呈现相类似的黄化表型。因此本研究以拟南芥WHY突变体和CIPK14突变体为研究材料,通过双向电泳(2-DE)蛋白质组学技术分析4周野生型(WT),WHIRLY1敲除突变体(kowhy1),WHIRLY1/WHIRLY13双敲除突变体(why1why3,ko1/3)和CIPK14过表达突变体(oeCIPK14)莲座叶中差异表达的蛋白,利用qRT-PCR对差异表达蛋白编码基因的表达水平进行转录水平的分析。对植物叶片中叶绿素的含量以及叶绿素荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线进行测定,分析植物光合作用性能。挑选光合作用的光反应复合体相关蛋白LHCA1,CYTF,PSBP和PSBR进行Western blot分析。主要研究结果如下:1、通过2-DE分离4周的WT,kowhy1,ko1/3和oeCIPK14莲座叶中的全蛋白,利用Image MasterTM 2D Platinum 7.0软件定量分析,每张蛋白图谱上都检测到800个以上的蛋白点。与WT相比,在kowhy1和ko1/3的正常表型中都未出现显著差异表达蛋白,在ko1/3黄化株系(ko1/3-var)中,有33个蛋白出现显著差异表达;在oeCIPK14-var中,有34个蛋白出现显著差异表达。有趣的是,在ko1/3-var和oeCIPK14-var中发现5个具有显著差异的重叠蛋白。经过MALDI-TOF/TOF-MS鉴定后,其中66个蛋白被成功鉴定,5个重叠蛋白分别是ATP依赖的clp蛋白酶水解亚基相关蛋白3,Rubisco大亚基,β-淀粉酶3,核糖体循环因子,Rubisco小亚基。差异表达蛋白功能分析结果显示,参与光合作用,氨基酸与蛋白代谢和防御抗氧化的蛋白占主要部分。聚类分析结果显示,在ko1/3-var和oeCIPK14-var中多个光合作用和防御和抗氧化相关蛋白出现上调表达,卡尔文循环途径中多个关键性的催化酶出现下调表达。2、在ko1/3-var中挑选26个差异表达蛋白的编码基因,利用qRT-PCR分别在WT,ko1/3-var和WHY1过表达突变体(oeWHY1)中进行转录水平验证。有13个基因的表达趋势与蛋白表达趋势一致,其中6个基因达到显著性差异;13个基因的表达趋势与蛋白表达趋势相反,其中8个基因达到显著性差异。在oeCIPK14-var中挑选27个差异表达蛋白的编码基因,在WT,CIPK14敲除突变体(kocipk14)和oeCIPK14-var中分析发现有19个基因的表达趋势与蛋白表达趋势一致,其中17个基因达到显著性差异;8个基因的表达趋势与蛋白表达趋势相反,其中5个基因达到显著性差异。5个重叠差异表达蛋白的编码基因中,ATP依赖的c1p蛋白酶水解亚基相关蛋白3在oeCIPK14-var中和核糖体循环因子在ko1/3-var中的表达趋势与蛋白表达趋势一致。3、光合作用性能分析表明oeCIPK14-var的叶绿素含量明显低于WT,ko1/3--var和oeCIPK14-var 的 Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qP 和 ETR 与 WT相比显著降低,Y(NO)和NPQ呈现增高趋势,植物叶片对强光响应性能降低。4、通过Western blot检测分析发现PSBR和PSBP在oeCIPK14-var中蛋白表达水平降低,其中PSBR表达趋势与2-DE中的表达趋势一致。LHCA1在ko1/3-var中表达量升高,CYTF在ko1/3-va r和oeCIPK14-var中表达量都升高。综上所述,本研究发现WHY1/WHY3同时缺失和CIPK14过表达造成质体亚型WHY1蛋白缺失引起植物叶片黄化时,光合作用光反应相关蛋白 HCF101、ChlI-2、CP26、PPD4、TROL、cyt f 均上调表达,维持光合作用电子传递链氧化还原状态;卡尔文循环途径相关蛋白RuBisCO、RCA、PGK、CA均下调表达,植物CO2固定效率下降。光合速率显著降低,对强光相应更加敏感。能量代谢紊乱可能引起叶绿体中ROS增加,促使抗氧化蛋白上调表达以清除ROS。本研究从蛋白水平上揭示WHY1作为一种信号分子传递光合作用中电子传递链上的氧化还原信号到细胞核,改变的核基因编码蛋白的表达水平,调控植物叶片的早期发育。