背景与目的颅内动脉瘤(intracrartial aneurysm,ICA)系颅内动脉血管壁形成的血管瘤样病变,一旦破裂便引起蛛网膜下腔出血。而且颅内动脉瘤破裂导致的死亡率和致残率非常高,所以ICA威胁着患者的生命健康,也给家庭和社会也带来了沉重的负担。颅内动脉瘤的发生存在着许多影响因素,其环境因素主要包括:高血压、抽烟、性别、酗酒、年龄、吸毒、季节等,前三项风险因素最为重要,也很可能是环境因素和遗传因素共同作用促进了疾病的发生,但是现在研究显示,遗传因素在ICA的发病中也占据重要的地位。常染色体显性遗性多囊肾病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,即:ADPKD)是临床上最常见的遗传性疾病之一,ADPKD是单基因遗传病,其患病率约为1/1000-1/400[1],大约3/5的患者都存在家族性遗传史。而且此遗传病的外显率高,可达95%以上,80岁以上的携带者几乎均显示出该病的某些征象。ADPKD具有明显的遗传延迟性,其发病一般主要在中年以后,其病理特点主要表现在双侧肾脏上,可形成许多大小不等的液性囊肿,伴随着囊肿的不断增大,肾脏结构会遭到破坏,随之肾脏功能也随之丧失,最终发展为尿毒症,肾脏功能衰竭。通过临床观察发现:大约50%的患者,在60岁左右即会发展到终末期肾脏功能衰竭阶段[2],所以目前肾脏功能衰竭是临床成人多囊肾病最常见的死亡原因之一。ADPKD是一种系统性的遗传性疾病,它的病变主要累及在双侧肾脏,除此之外还可波及到患者的肝脏、胰腺、脾脏、卵巢及全身心血管等多个系统,如发生在组织器官,可形成肝囊肿、脾囊肿、胰囊肿、卵巢囊肿和精囊囊肿等等;在全身心血管系统中,在冠状动脉、颅内动脉等动脉处均可形成大小不等的动脉瘤,如若动脉瘤发生在腹股沟处,患者可导致腹股沟疝,如发生在心脏瓣膜处,可导致心脏瓣膜异常,如瓣膜关闭不全等病变。PKD1、PKD2和PKD3基因是国内外已经报道的、引起ADPKD三种主要受累基因,而从目前研究发现,PKD1基因是引起ADPKD的最主要致病基因。高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)技术是在国内外发展起的一种新型的遗传学检测方法。HRM技术源于熔解曲线,所以它是在实时荧光定量PCR的基础上,仅仅是增加改进了一种新型的荧光饱和染料,即:它是利用一种绿色的荧光饱和染料不断监控核酸双链变化情况,随后通过熔解曲线走形而进行分析。HRM技术不受突变碱基种类与位点的局限,具有速度快、操作简便、成本低,灵敏度和特异性高、准确率高和实现真正的闭管操作等优点,从而被迅速而广泛的应用到基因突变扫描,基因分型与序列匹配,甲基化分析,短片段重复序列与RNA编辑等多方领域中。本研究中采用高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术检测常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)及其伴发颅内动脉瘤(ICA)患者的PKD1基因的突变,从而建立一种简便而又可靠的筛查、检测PKD1基因突变的方法,分析突变产生的位置和形式,从而进一步推断其发病机制,并探讨HRM技术特点,以及其用于临床ADPKD患者筛查与诊断的可行性。方法收集整理2013年7月到2014年8月上海交通大学附属第六人民医院收治的ADPKD患者,所有患者均经B超、CT、磁共振血管成像法筛选患有颅内动脉瘤的患者,共收集ADPKD伴发ICA患者32例。采集32例患者术前清晨空腹外周血4m L,置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,随后倒入医用干纱布上,晾干制成干血痕。常规酚-氯仿法抽提32例患者的基因组DNA。设计PCR反应和HRM分析所需的引物,对PCR反应条件进行优化,并扩增目的基因片段。随后用HRM法检测32例ADPKD患者PKD1基因的1到46号外显子的突变情况,并对HRM结果中,怀疑为突变的基因样本进行直接测序验证,从而确定样本存在的突变类型。结果通过HRM技术对32例ADPKD伴发ICA患者的46个外显子的56个片段区域进行检测分析,有4对外显子引物未得到熔解曲线图,从获得的熔解曲线峰形图中可知,有9例(1、7、8、9、10、16、18、20和28号)患者存在28条异常的熔解曲线,9例患者标本经测序法得到证实,均存在PKD1基因的突变。本实验中共检出62个位点突变,其突变率为28.13%:62个突变均为点突变,其中错义突变28种,无义突变1种,同义突变12种。62个突变分布于13个外显子,其中11和15号外显子突变最多,均为12例,分别占总突变的19.36%;10号外显子9例突变,占14.52%;13号外显子8例突变,占12.90%;5和25号外显子均存在4例突变,分别占6.45%;29号外显子3例突变,占4.84%;7、16、23和26号外显子均存在2例突变,分别占3.23%;27和38号外显子均存在1例突变,分别占1.61%。直接测序法证实两种方法的检测结果完全一致。结论用HRM法能快速、灵敏、准确的检测出ADPKD患者PKD1基因的突变情况,不仅可以检测出已知的基因突变,而且可以简便、快捷的筛查出一些未知的突变。经分析得出:新兴的HRM技术具有操作简便快速、实验结果准确、成本低、灵敏度高及其特异性高等优点,可作为ADPKD患者及ADPKD家族携带者的突变检测与筛查的优选方法,适合在临床推广。