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背景同型半胱氨酸(Homocystein,Hcy)是动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因素,参与心血管和脑血管事件的发生。有研究已证实Hcy氧化过程中通过含有金属的酶蛋白催化,产生活性氧物质,进而导致血管内皮功能障碍。此外临床研究表明诊断为高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy)的患者,血浆Hcy和Cu2+的浓度同步升高,且两者呈正相关,而此现象在患有心血管疾病人群中尤为常见。这表明在Hcy损伤内皮细胞过程中Cu2+起重要作用。并且随着对Hcy-Cu复合物新的认知,发现在动脉粥样硬化形成过程中Hcy-Cu复合物也起到了非常重要的作用。ZnMoS4是一种具有对铜离子极高选择性的新型纳米颗粒离子交换剂,不仅能穿透细胞膜充当细胞内的铜解毒剂,还能保持其他必须生物金属离子的稳态。我们前期研究已证实:与单独Hcy、Cu2+处理培养的脐静脉内皮细胞相比,Hcy联合Cu2+可明显加重对细胞的损伤,降低细胞存活率。其机制可能是Hcy依赖Cu2+作用激活糖酵解通路和NADPH氧化酶,抑制谷胱甘肽(glutathione,GSH)抗氧化系统,生成过多ONOO-造成内皮氧化损伤。本实验将进一步动物体内证明Hcy可联合Cu2+对血管产生更严重的损伤和损伤的可能机制,并探讨ZnMoS4对Hcy损伤大鼠主动脉的保护作用,以及推测Hcy-Cu复合物的可能分子式。第一部分Hcy损伤大鼠主动脉内皮目的:探讨Hcy对大鼠主动脉具有的损伤作用。方法:建立HHcy大鼠模型,选取10只6周龄SD雄性大鼠随机分为2组,每组5只:①正常蛋氨酸组(4.6g/kgMet);②高蛋氨酸组(7.5g/kgMet);每组饲料喂养8周,监测大鼠体重,实验结束后眼球动脉采血检测血清中Hcy溶度;解剖大鼠取主动脉用于血管环张力测定、HE染色、透射电镜实验,观察大鼠主动脉的损伤程度;结果:与正常组相比,高蛋氨酸组主动脉内皮依赖性舒张功能减弱,主动脉内皮细胞明显破坏并伴有线粒体损伤。结论:体内Hcy浓度增加可损伤主动脉内皮细胞。第二部分 Hcy联合Cu2+损伤主动脉的机制研究目的:探讨Hcy联合Cu2+损伤主动脉的机制。方法:实验一:准备30只6周龄SD雄性大鼠随机分为6组,每组5只:①低铜对照组(1.6mg/kg Cu);②正常铜对照组(1Omg/kg Cu);③高铜对照组(300mg/kg Cu);④低铜+高蛋氨酸组(1.6mg/kg Cu+7.5g/kgMet)⑤正常铜+高蛋氨酸组(10mg/kg Cu+7.5g/kgMet);⑥高铜+高蛋氨酸组(300mg/kg Cu+7.5g/kgMet);每组饲料喂养8周,监测各组大鼠体重,实验结束后解剖所有模型大鼠,活体下取出主动脉用于血管环张力测定、HE染色、透射电镜实验,观察大鼠主动脉的损伤程度。实验二:20只6周龄雄性SD大鼠随机分为4组,每组5只:①正常铜对照组(10mg/kg Cu);②低铜+高蛋氨酸组(1.6mg/kg Cu+7.5g/kgMet);③正常铜+高蛋氨酸组(1Omg/kg Cu+7.5g/kgMet);④高铜+高蛋氨酸组(300mg/kg Cu+7.5g/kgMet);每组饲料喂养8周,监测各组大鼠体重,实验结束后眼球动脉采血测血清乳酸含量,解剖所有模型大鼠活体下取出主动脉用于HE染色,免疫组化,荧光染色法检测血管ROS及NOX活性;结果:实验一:正常铜、低铜、高铜组大鼠主动脉血管舒张功能相似,病理结果未见主动脉内皮损伤;正常铜+高蛋氨酸组、低铜+高蛋氨酸组、高铜+高蛋氨酸组血管舒张功能较①②③组明显减弱,且高铜+高蛋氨酸组<正常铜+高蛋氨酸组<低铜+高蛋氨酸组;内皮细胞破坏、线粒体损伤程度较前三组明显增大,高铜+高蛋氨酸组>正常铜+高蛋氨酸组>低铜+高蛋氨酸组。实验二:与正常对照组相比,正常铜+高蛋氨酸组、高铜+高蛋氨酸组主动脉己糖激酶Ⅱ、gult1、及NOX亚基蛋白表达含量增加、ROS和NOX活性明显增强、内皮细胞破坏、线粒体损伤程度严重,且与铜浓度成正比;3-NT蛋白的表达随着铜浓度的增加而减少。结论:血清中Cu2+的含量不影响正常Hcy对血管的作用,但在HHcy中,随着铜含量的增加可加重Hcy对主动脉的损伤,其机制可能是是通过激活NADPH氧化酶和糖酵解途径,产生ROS;同时生成过多ONOO-造成内皮细胞氧化损伤。第三部分 纳米铜交换剂(ZnMoS4)对Hcy损伤主动脉的保护作用目的:探讨ZnMoS4对Hcy损伤主动脉的保护作用方法:实验一:原代提取人脐静脉内皮细胞,将细胞分为如下四组:①正常组,②Hcy+Cu2+组,③Hcy+Cu2++四硫钼酸盐(TM)组(2,5,10,50uM/L),④Hcy+Cu2++纳米铜离子交换剂(ZnMoS4)组(2,10,50,100uM/L),加药处理24小时后,流式细胞仪检测细胞存活率;同时急性药物毒性试验比较两者毒性的强弱。实验二:选取15只6周龄SD雄性大鼠随机分为3组,每组5只:①正常对照组;②高蛋氨酸组(7.5g/kgMet);③高蛋氨酸组+纳米铜螯合剂组(7.5g/kgMet+ZnMoS4):喂养1周后加入ZnMoS4(40ml ZnMoS4加入在2Kg鼠粮中)。每组饲料喂养8周,监测大鼠体重,麻醉后解剖所有模型大鼠,活体下取出主动脉用于荧光检测仪测试血管环NOX活性、HE染色、透射电镜实验。结果:实验一:Hcy+Cu2+加入不同溶度的TM和ZnMoS4均能提高细胞生存率,但ZnMoS4的毒性比TM小很多。实验二:与高蛋氨酸组相比,高蛋氨酸+ZnMoS4组大鼠血管环NOX活性升高程度明显减小,内皮细胞破坏、线粒体损伤程度显著减弱。结论:ZnMoS4对Hcy损伤主动脉具有保护作用。第四部分 Hcy与Cu2+络合物鉴定目的:鉴定Hcy-Cu2+络合物方法:采用基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-TOF)、高效液相色谱-线性离子阱质谱法(ESI-MS)和核磁共振波谱法(NMR)。结果:高效液相色谱-线性离子阱质谱法色谱图中出现365.9m/z、367.9m/z、369.98m/z三个质核比相差2的峰谱,核磁共振波谱中Hcy-Cu2+络合后峰变少、变宽并发生位移。结论:Hcy与Cu2+可形成络合物。