【摘 要】
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近来发现野生型抑癌基因KLF6在前列腺癌中的突变率高达77%,且有高度特异性。本研究克隆了野生型KLF6基因,将其重组质粒转染入前列腺癌PC-3细胞,观察了KLF6对PC-3细胞生长增殖
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近来发现野生型抑癌基因KLF6在前列腺癌中的突变率高达77%,且有高度特异性。本研究克隆了野生型KLF6基因,将其重组质粒转染入前列腺癌PC-3细胞,观察了KLF6对PC-3细胞生长增殖、细胞周期、对Bcl-2和Cyclin D1蛋白表达的影响等,分四个部分简述如下。 第一部分:抑癌基因KLF6的克隆及质粒的构建 [目的] 从正常人体中提取总RNA,利用RT-PCR法反应获得目的基因野生型KLF6的cDNA片断,构建具备可进行细胞转染和容易被识别筛选的KLF6-pEGFP-C1质粒载体。 [材料和方法] 应用Trizol法从人体正常肝脏细胞中提取mRNA,按GeneBank公布的野生型KLF6基因序列及文献设计引物序列:5’端引物:5’-AAGGTACCATGGACGTGCTCCCTATGTGC-3’;3’端引物:5’-CGTCTAGATCAGAGGTGCCTCTTCATGTG-3’。RT-PCR反应在94℃lmin,60℃1.5min,72℃2min,最后在72℃延伸8min条件下进行30个循环,获得852bp大小的野生型KLF6的cDNA片段pKLF6。pKLF6用内切酶BamH I和EcoR I双酶切,真核表达载体pEGFP-C1同样用BamH I和EcoR I双酶切,二者进行连接反应,构建包含目的基因KLF6的重组质粒pEGFP-C1-KLF6。 [结果] 使用Trizol法分离和提取得到正常人体的总RNA,通过RT-PCR法反应获得目的基因野生型KLF6的cDNA片断,构建完成了能够稳定表达和具有筛选特征的KLF6-pEGFP-C1质粒载体,使其成为可进行细胞转染和易被识别的穿梭质粒,供后续转染和表达实验使用。 [结论] Trizol法简便快速地提取到正常人体的总RNA,RT-PCR法反
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