目的：　　Alzheimers disease(AD)又称老年性痴呆，在老年人群中具有很高的发病率，导致严重健康损害和沉重的家庭社会负担。最新研究认为，脑内Aβ沉积是AD最核心的病理事件，而且，多数AD预防与治疗相关研究都以促进脑内Aβ的清除为主要切入点。　　脑内细胞间可溶性Aβ的清除途径有:细胞吞噬并降解、跨血脑屏障入血、跨血CSF屏障入CSF、间质液整体流沿血管旁途径出脑、随CSF向循环系统和淋巴系统引流。近年来研究证实，硬脑膜内存在有经典淋巴管，CSF(cerebrospinal fluid，CSF)中的细胞和可溶成分可沿此引流至颈深淋巴结(deep cervical lymph nodes，LNdCs)。这一发现意味着硬脑膜淋巴管在某些CNS生理功能和病理进程、乃至疾病的预防和治疗中具有重要的作用。　　最新文献推测，在脑源性Aβ的清除中脑膜淋巴管对CSF的引流可能起重要作用。本研究的目的之一即是能证实这一假设，以期AD的预防和治疗提供新的理论依据。　　方法：　　1.实验动物　　AD转基因模型APP/PS-1小鼠购买自广东省医学动物实验中心（佛山，中国）。野生型(WT)C57B1/6J小鼠购自中山大学实验动物中心（广州，中国）。本研究各项操作均严格按照中山大学实验动物福利和动物伦理学要求进行。所有实验动物的清洁级别均为SPF级。　　2.免疫荧光标记　　PBS心脏灌注去除血液后，剥取小鼠颅顶部硬脑膜，取颈、腹股沟淋巴结并切片。以上样本进行免疫荧光标记，指标包括:Lyve-1+、CD3e+、Lyve-1+/Prox1+、CD11b+/Lyve-1+、F4/80+/NF-κB-P65+、Lyve-1+/NF-κB-P65+等。　　3.免疫荧光标记后成像与分析　　使用LSM780共焦激光扫描显微镜观察和拍摄。硬脑膜样本主要观察横窦部位淋巴管，淋巴结切片则进行全样本拍照。共聚焦文件使用imaris8.4图像分析软件测量横窦区域内的脑膜淋巴管长度和表面积，估算淋巴结切片内Lyve-1+信号面积。各类标记的细胞数量统计则采用体视学系统显微镜软件Stereo Investigator完成。　　4.Aβ含量测定　　CSF、血清、淋巴结、脑、硬脑膜等体液或组织中的Aβ采用ELISA方法进行检测。所测Aβ包括单体(Monogomer，M-)Aβ1-40和M-Aβ1-42的含量与寡聚体(Oligomor，O-)Aβ。　　5.细胞因子水平测定　　购置小鼠细胞因子/趋化因子Luminex检测试剂盒检测CSF中IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-7、IL-17、IL-1β、IL-6、IL-10和CCL2(MCP-1)的含量，用Bio-Plex Manager软件对数据进行分析。CSF中血管内皮生长因子(VEGF-)C和VEGF-D的含量则使用ELISA试剂盒进行检测。　　6.Western blot　　依据文献报道的方法，提取各样本中的总蛋白，经BCA蛋白质分析试剂盒定量后，用western blot分析法检测硬脑膜Vegfr3、Prox-1和NF-κB-P65的表达量。　　7.Aβ脑室内注射　　依据文献采用的方法向小鼠小脑延髓池内注射M-Aβ1-4/PBS2或O-Aβ1-42/PBS。注射后CSF内各型Aβ浓度按模拟TG小鼠模型CSF中测得的Aβ水平计算。　　8.脑膜免疫细胞和炎症/淋巴管增殖相关信号通路抑制剂的使用　　累计两次向小鼠小脑延髓池注射PDTC或TAK-242，或腹腔注射米诺环素，注射时间为向小鼠小脑延髓池内注射M-Aβ1-42的24小时和12小时前。在另一组实验中，向小鼠小脑延髓池注入小鼠源抗TCR IgG2a抗体与M-Aβ1-42混合物。anti-TCR抗体的注射剂量按本实验室已发表的论文确定。　　9.统计分析　　使用SPSS21.0软件包对全部实验数据进行统计学分析。通过Students t-test、Welchs t-test、Pearsons相关分析、one-way ANOVA、two-way ANOVA或Nonparametric tests对数据进行统计学处理。所有结果都表示为Mean±SEM，当P值小于0.05时被定义具有统计学意义（*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001）。　　结果：　　1.CSF内Aβ经淋巴引流的证据　　WT小鼠仅脑内检测到微量M-Aβ1-40。在TG小鼠的脑、CSF、硬脑膜和LNdCs等四种组织中均检测到M-Aβ1-40和M-Aβ1-42，且LNdCs的含量均显著高于脑中含量。各型Aβ在WT和TG小鼠腹股沟淋巴结(LNIs)均未测到。以上结果表明，LNdCs中的Aβ应来自其引流的CNS（如CSF）来源的淋巴液。进一步实验，结扎WT小鼠颈深淋巴结的输入淋巴管，然后向小脑延髓池注射M-Aβ。假手术对照组不结扎输入淋巴管，其余操作步骤与手术组一致。手术组CSF内可检测到M-Aβ，但颈深淋巴结内检测不到M-Aβ。假手术组则在两种组织均可检测到。　　2.TG小鼠LNdCs体积增大，其内淋巴管密度增加　　TG小鼠较WT小鼠:LNdCs体积增大，LNdCs内Lyve-1+淋巴管面积增大。两种小鼠的LNIs各指标无显著性差异。　　3.TG小鼠硬脑膜淋巴管重构　　我们选取横窦区硬脑膜为代表区域评估脑膜淋巴管增殖水平。与WT小鼠相比，TG小鼠在3月龄和9月龄横窦区硬脑膜内淋巴管内皮细胞核(Prox1+)总数增多，dLVs(Lyve-1+)表面积增加，且单位淋巴管表面积内内皮细胞核数量也增加。此外，TG鼠脑膜促淋巴管增殖的分子（Prox1和Vegfr3）蛋白表达量升高。　　4.CSF内M-Aβ1-42和O-Aβ水平与硬脑膜淋巴管增殖水平的相关性分析　　我们将3月龄和9月龄TG小鼠CSF内M-Aβ1-40、M-Aβ1-42和O-Aβ水平与硬脑膜淋巴管增殖指标（Prox1+细胞数量/Lyve-1+淋巴管表面积的比值）做相关性分析。结果表明，该比值与CSF中Aβ1-40和Aβ1-42水平均呈正相关，而与CSF O-Aβ水平呈负相关。当照年龄龄分别进行相关性分析时，Aβ1-40与该比值不再呈正相关，而CSF Aβ1-42和CSF O-Aβ在区分月龄后相关性不变。这一结果提示:M-Aβ1-42和O-Aβ分别具有促进和抑制硬脑膜淋巴管增殖的作用。　　5.CSF内M-Aβ1-42与O-Aβ1-42水平影响淋巴管增殖相关细胞因子的水平　　与WT鼠相比，在3月龄和9月龄TG小鼠CSF均有较高的促淋巴管增殖因子（CCL2、VEGF-C、VEGF-D、IL-6和IL-1β），但在9月龄TG小鼠因子水平明显低于3月龄TG小鼠。给WT小鼠脑室内注射M-Aβ1-42使得CCL2、VEGF-C/D、IL-6水平升高，注射O-Aβ1-42则使CCL2、VEGF-C/D水平降低。　　6.TG小鼠硬脑膜巨噬细胞转变为LEC祖细胞(CD11b+/Lyve-1+)现象增多　　在脑膜淋巴管内或附近，可观察到CD11b+/Lyve-1+细胞。TG小鼠硬脑膜的该类细胞数量在3月和9月龄均高于WT小鼠，但在9月龄TG鼠低于3月龄TG鼠。　　7.巨噬细胞介导Aβ对淋巴管增殖的影响　　3组3月龄WT小鼠分别接受给以下药方案:M-Aβ1-42(icv)、M-Aβ1-42(icv)/米诺环素(minocycline)(ip)或M-Aβ1-42(icv)/anti-TCR(icv)抗体。24小时后检测CSF中VEGF-C水平、硬脑膜Prox1和Vegfr3的蛋白表达水平。发现抑制巨噬细胞活化可阻断M-Aβ1-42对淋巴管增殖的促进作用，但封闭TCR则无显著影响。　　8.TLR4/NF-κB信号通路介导Aβ对淋巴管增殖和趋化募集巨噬细胞的影响　　我们发现3月龄和9月龄TG小鼠硬脑膜巨噬细胞(F4/80+)和LECs(Lyve-1+)内NF-κB-p65表达显著高于WT小鼠。给WT小鼠脑室内注射M-Aβ1-42增加两种细胞的NF-κB-p65表达，而注射O-Aβ1-42则降低表达。用PDTC阻断NF-κB信号通路可阻断M-Aβ1-42对CSF中VEGF-C和CCL2表达量的增加效应。类似地，TLR4的抑制剂TAK-242可完全阻断因注射M-Aβ而引起的NF-κB表达增加。TLR4/NF-κB信号通路起着介导M-Aβ诱导的淋巴管增殖和巨噬细胞募集的作用。　　结论：　　1.脑膜淋巴管和LNdCs具有重要的引流和清除CNS Aβ的功能。　　2.CSF内Aβ可诱导dLVs重塑。　　3.M-Aβ1-42促进淋巴管增殖，而O-Aβ1-42抑制淋巴管增殖　　4.巨噬细胞募集和活化介导Aβ诱导脑膜淋巴管重构　　5.TLR4/NF-κB信号通路在M-Aβ诱导的淋巴管增殖和巨噬细胞募集起重要作用。