蟾酥是一味具有悠久应用历史的传统中药，具有解毒消肿、止痛开窍之功效，常用于治疗疮黄疔毒、咽喉肿痛和中暑神昏等病证。现代药理学研究证明蟾酥具有提高疫苗免疫效力、抗肿瘤、强心和镇痛等药理作用。兽医临床应用蟾酥原药治疗猪无名高热和猪气喘病等取得了很好的治疗效果。然而蟾酥原药刺激性大，操作不便，限制了其在兽医临床上的应用。为此，我们运用现代兽药制剂技术将中药蟾酥制备成了蟾酥缓释注射液(SIVB），该制剂具有安全、长效和使用方便的特点。安全、有效和质量可控是现代兽药制剂的基本要求，因此，我们在前期安全性试验的基础上，按照我国兽药管理规范对SIVB进行药效学研究，为其进一步在临床上的应用奠定基础。根据相关文献报道，蟾酥可以提高疫苗免疫效力，具有免疫佐剂的活性。免疫佐剂可通过促进Th1、Th2或Th17免疫应答提高疫苗免疫效力。因此我们首先以鸡卵清白蛋白（OVA）为模式抗原，研究SIVB对Th1、Th2和Th17免疫应答的影响。对ICR小鼠于第1d和第15d分别皮下注射免疫OVA（100μg），同时于第1d皮下注射SIVB（0.05ml、0.1ml和0.2ml）。二免2周后，采集血清，ELISA法测定血清OVA-specific IgG及其亚类IgG1和IgG2a水平；制备脾淋巴细胞悬液，MTS法测定刀豆蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）诱导的脾淋巴细胞增殖，ELISA法测定OVA刺激的脾淋巴细胞上清IFNγ、IL-4和IL-17A水平。结果可知，SIVB能显著提高OVA免疫小鼠血清OVA-specific IgG及其亚类IgG1和IgG2a水平，显著促进了ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞增殖，显著促进了脾淋巴细胞分泌IFNγ、IL-4和IL-17A。结果表明SIVB可以同时促进OVA诱导的Th1免疫应答、Th2免疫应答和Th17免疫应答。为阐明SIVB的药效物质基础，我们进一步研究了SIVB中远华蟾酥毒基（TBG）和华蟾酥毒基（CBG）两种成分对OVA诱导的Th1、Th2和Th17免疫应答的影响。对ICR小鼠于第1d和第15d分别皮下注射免疫OVA（100μg）、TBG（10μg、20μg和40μg）+OVA（100μg）、CBG（10μg、20μg和40μg）+OVA（100μg）。二免2周后，采集血清，ELISA法测定血清OVA-specific IgG及其亚类IgG1和IgG2a水平；制备脾淋巴细胞悬液，MTS法测定ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞增殖，ELISA法测定OVA刺激的脾淋巴细胞上清IFNγ、IL-4和IL-17A水平，RT-PCR法测定T-bet、GATA-3和RORγt mRNA表达水平，流式细胞法测定小鼠脾淋巴细胞CD3+亚群比例。结果可知，TBG和CBG可以提高OVA免疫小鼠血清OVA-specific IgG及其亚类IgG2a水平，促进脾淋巴细胞分泌IFNγ及其T-bet mRNA表达，提高了小鼠脾淋巴细胞中CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+比率。此外，TBG对OVA免疫小鼠血清OVA-specific IgG1水平无显著影响，对脾淋巴细胞IL-4和IL-17A分泌及其GATA-3和RORγt mRNA表达水平无显著影响；CBG显著降低OVA免疫小鼠血清OVA-specific IgG1水平，显著抑制脾淋巴细胞IL-4的分泌及GATA-3mRNA表达水平，对脾淋巴细胞IL-17A的分泌及RORγt mRNA表达水平无显著影响。结果表明，TBG和CBG可以促进OVA诱导的Th1免疫应答，其机制可能与促进脾淋巴细胞表达T-bet mRNA有关。前面的研究结果表明SIVB及其成分TBG和CBG具有促进疫苗Th1免疫应答的作用，我们推测SIVB及TBG和CBG可以作为胞内病原体疫苗的免疫佐剂，增强机体的抗胞内病原体作用。为此，我们进一步研究了SIVB及其成分TBG和CBG对福尔马林灭活鼠伤寒沙门氏菌疫苗（FIST）免疫效力的影响。对ICR小鼠于第1d和第15d分别皮下注射免疫FIST（106CFU），含有CBG（10μg、20μg和40μg）和TBG（10μg、20μg和40μg）的FIST（106CFU），或皮下蟾酥注射液0.2ml和FIST（106CFU）。二免2周后，采集血清，ELISA法测定血清FIST-specific IgG及其亚类IgG1和IgG2a水平；制备脾淋巴细胞悬液，MTS法测定ConA、LPS和FIST诱导的脾淋巴细胞增殖，ELISA法测定FIST刺激的脾淋巴细胞上清IFNγ、IL-4、IL-17A和NO水平；口服感染鼠伤寒沙门氏菌，通过小鼠脾脏细菌载量和小鼠存活率评价FIST疫苗保护作用。结果显示，SIVB、TBG和CBG可以显著提高FIST免疫小鼠血清FIST-specific IgG和IgG2a水平，促进ConA、LPS和FIST诱导的脾淋巴细胞增殖，促进分泌IFNγ和NO分泌。此外，SIVB显著提高IgG1水平，显著促进脾淋巴细胞分泌IL-4和IL-17A；TBG和CBG显著降低IgG1和IL-4水平，对IL-17A无显著影响。攻毒试验表明SIVB及其成分TBG和CBG均可以显著降低FIST免疫小鼠脾脏细菌载量，延长其生存时间。结果表明SIVB、TBG和CBG可以促进FIST诱导的Th1免疫应答，增强FIST免疫小鼠抗鼠伤寒沙门氏菌感染能力。为了进一步确定SIVB是否通过促进FIST诱导的Th1免疫应答来提高FIST疫苗的保护效果，我们采用体内中和IFNγ的方法研究IFN对SIVB、TBG和CBG对FIST免疫小鼠的保护作用。对ICR小鼠皮下注射Saline、FIST（106CFU）、TBG（20μg）、TBG（20μg）+FIST（106CFU）、CBG（20μg）、CBG（20μg）+FIST（106CFU）、SIVB（0.2ml）、SIVB（0.2ml）+FIST（106CFU）。同时，于第1d、8d、15d和22d，腹腔注射800g anti-IFN mAb或rat IgG2a controlmAb。二免2周后，采集血清，ELISA法测定血清FIST-specific IgG1和IgG2a水平；制备脾淋巴细胞悬液，ELISA法测定FIST刺激的脾淋巴细胞上清IFNγ和IL-4水平；口服感染鼠伤寒沙门氏菌，通过小鼠脾脏细菌载量和小鼠存活率评价机体抗鼠伤寒沙门氏菌能力。结果可知，在Anti-IFN mAb中和IFN后，SIVB+FIST、TBG+FIST和CBG+FIST免疫小鼠血清FIST-specific IgG2a水平和脾淋巴细上清IFNγ含量显著下降；TBG+FIST和CBG/FIST免疫小鼠血清FIST-specific IgG1水平和脾淋巴细上清IL-4含量显著升高，而SIVB+FIST组小鼠血清IgG1水平和脾淋巴细上清IL-4含量无显著变化。在Anti-IFN mAb中和IFN后，SIVB、TBG和CBG组小鼠脾脏细菌载量显著升高，小鼠存活时间明显缩短；且SIVB+Anti-IFN、TBG+Anti-IFN、CBG+Anti-IFN组与Saline+Anti-IFN组小鼠脾脏细菌载量差异不显著，小鼠的存活时间的无明显差异。在Anti-IFN mAb中和IFN后，SIVB+FIST、TBG+FIST和CBG+FIST组小鼠脾脏细菌载量显著升高，小鼠存活时间明显缩短；SIVB+FIST+Anti-IFN、TBG+FIST+Anti-IFN、CBG+FIST+Anti-IFN组与FIST+Anti-IFN组小鼠脾脏细菌载量差异不显著，小鼠的存活时间的无明显差异。上述结果显示体内中和IFN可解除SIVB、TBG和CBG对FIST免疫小鼠的保护作用，表明SIVB、TBG和CBG通过促进Th1免疫应答，提高FIST疫苗的保护效果。上述研究结果表明SIVB可以促进Th1免疫应答，提高疫苗保护效率，为其在临床上的应用提供了依据。为了进一步为临床研究打基础，我们初步研究了SIVB对靶动物猪的用药安全性和有效性。仔猪按常规免疫程序接种猪圆环病毒2型疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗和猪瘟疫苗，同时卡耳穴注射SIVB2ml。在给药2周后，前腔静脉采血，通过血清生化指标和血液常规指标评价SIVB对靶动物猪的用药安全性。在给药后，每周称量体重，前腔静脉采血，ELISA测定猪圆环病毒2型疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗和猪瘟疫苗抗体水平及血清IFNγ和IL-2水平，评价SIVB的有效性。结果可见，在给药后，SIVB组和空白载体组体重、血液生化指标和血清生化指标无显著差异。给药2周或3周后，SIVB组猪圆环病毒2型疫苗抗体、猪繁殖与呼吸综合征疫苗和猪瘟疫苗抗体水平均显著高于空白载体组和生理盐水对照组。给药1周后，SIVB组血清IFNγ和IL-2水平显著高于空白载体组和生理盐水对照组。结果表明SIVB对靶动物猪具有良好的用药安全性，可以用于提高猪瘟等疫苗免疫效果。综上所述，SIVB、TBG和CBG可以促进OVA和FIST诱导的Th1免疫应答，增强FIST免疫小鼠抵抗沙门氏菌感染能力。SIVB对靶动物猪具有良好的用药安全性，可以提高血清猪圆环病毒疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗和猪瘟疫苗抗体水平，同时提高血清IFNγ和IL-2水平，为SIVB在临床上的应用提供了实验依据。