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CRISPR/Cas系统是古细菌和细菌在长期演化过程中生成的一种适应性免疫,可用来抵抗外源DNA及病毒的入侵。人为改造的CRISPR/Cas9基因编辑技术,则是通过sg RNA的引导对基因进行定向的切割产生DNA双链的断裂,利用生物体自身的同源重组（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）的修复机制,达到对DNA修饰的目的,目前该技术在基因编辑修饰中的应用最为广泛。作为重要的经济作物和模式植物之一的烟草（Nicotiana tabacum）,有着重要的研究价值。但是由于栽培烟草是异源四倍体且基因组庞大复杂,在利用CRISPR/Cas9技术进行编辑时,T0代转化植株出现嵌合的比例较高且基因编辑效率低的问题,若进行烟草的大规模基因编辑,若以目前的基因敲除系统,会在实际生产中耗费大量的人力物力财力。因此,本研究期望通过替换Cas9蛋白以及替换表达Cas9蛋白的启动子和终止子元件以达到优化CRISPR/Cas9系统的目的,从而降低嵌合体的产生,提高基因的编辑效率。目前获得如下结果:一、基于xCas9 3.7的CRISPR/xCas9敲除载体的构建及突变效率检测为了获得适用于烟草基因编辑的xCas9,我们将文献报道的xCas9 3.7进行了密码子优化,获得了适用于烟草基因编辑的nxCas9,并将其构建到敲除载体上。获得pORE-nxCas9载体。我们选择了Nt PDS和Nt PDR两个基因为靶标,分别在NG、NGG、GAA、GAT四个PAM区设计了两个sg RNA,将含有sg RNA的pORE-nxCas9新敲除载体和对照敲除载体pORE-sp Cas9分别转化到农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化、组织培养技术和分子检测,获得了T0代编辑植株。Sanger测序结果显示,在Nt PDR基因NGG PAM区,xCas9的编辑效率（30%-35%）比sp Cas9的编辑效率（20%-25%）高10%左右;在Nt PDS基因NGG PAM区,xCas9的编辑效率（15%-25%）和sp Cas9的编辑效率（20%-25%）没有明显的变化;在非NGG PAM区,只有在Nt PDR基因的NG PAM区发现一株突变（5%）。该结果表明了基于xCas9 3.7的CRISPR/xCas9敲除载体对基因和靶位点选择上有一定的的偏好性,在NG的PAM区上xCas9也检测到了编辑,一定程度上拓宽了基因编辑在Cas9 PAM区的选择性。二、烟草NtEC1.2-1/2和NtDMC1-1/2启动子的敲除载体的构建及突变效率检测通过与拟南芥中已报到的生殖细胞特异性启动子基因（At EC1.2,AtDMC1）的氨基酸序列比对,发现了四条与之同源的基因,命名为NtEC1.2-1,NtEC1.2-2,NtDMC1-1,NtDMC1-2。启动子元件分析结果表明,NtEC1.2和NtDMC1启动子都含有细胞分裂M时期特异性元件（AACGG）、参与花粉特异性转录激活元件（GAAA）和早期激活因子的靶点（AACTTAA）。这些特异性元件的存在说明我们所挑选的启动子是烟草生殖时期表达的。RT-PCR检测结果显示NtEC1.2-1、NtEC1.2-2、NtDMC1-1和NtDMC1-2四个基因都在花药中高量表达,且NtEC1.2-1在子房中也是高量表达的。e GFP荧光分析结果表明NtEC1.2-1,NtEC1.2-2,NtDMC1-1,NtDMC1-2四个启动子能驱动e GFP在叶片中表达,表明4个启动子在烟草叶片中有活性。转基因植株GUS染色结果表明,NtEC1.2-1启动子能驱动GUS在子房和种子中表达,有明显的蓝色出现;其它三个启动子（NtEC1.2-2、NtDMC1-1和NtDMC1-1）不能驱动GUS在以上两个组织中表达,没有蓝色。将构建的含有烟草内源的生殖特异性启动子表达的Cas9蛋白敲除载体（NtEC1.2-1-Cas9-rbcS-E9、NtEC1.2-2-Cas9-rbcS-E9、NtDMC1-1-Cas9、NtDMC1-2-Cas9）以及对照质粒At EC1.2-Cas9-rbcS-E9分别转入到农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化和组织培养技术,获得T0代转基因植株。由于烟草的生长周期较长,我们对T0代瞬时注射早花农杆菌,加快获得了T1代转基因植株。通过对T1代转基因植株测序发现,对照组pORE-At EC1.2-rbcS-E9植株的突变效率为20%,并且全部为杂合体,没有嵌合体和纯合体的产生。实验组也没有产生嵌合体,其中pORE-NtEC1.2-2-rbcS-E9、pORE-NtDMC1-1、pORE-NtDMC1-2的突变效率为5%-10%,低于对照组;pORE-NtEC1.2-1-rbcS-E9植株突变效率为26.7%。综上,本研究通过替换Cas9蛋白和替换表达Cas9的启动子这两种方法,构建了不同的敲除载体,通过检测发现xCas9有着基因和靶位点的偏好性,在Nt PDR基因的编辑效率高于sp Cas9,但其是否具有普遍性还需要进一步的验证。而使用烟草内源的生殖特异性启动子表达的Cas9构建的敲除载体,检测结果发现得到的突变株全部是杂合体,没有嵌合体的出现。其中,烟草的pORE-NtEC1.2-1启动子和rbcS-E9终止子的组合于对照组的基因编辑效率相当。虽然在本研究中,我们没有在很大程度上提高烟草的基因编辑效率,但是它们给我们提供了一个很好的开始,后续可以通过优化启动子或者筛选找出活性更高的启动子来提高烟草的基因编辑效率。对于后续烟草基因功能研究和突变体素材的创制都有着重要意义。