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肿瘤疫苗是目前肿瘤生物治疗的重要方法,它利用肿瘤特异性抗原进行主动免疫来激活和增强机体对肿瘤的免疫应答水平。表皮生长因子受体2(HER2/neu),是一种185KD的跨膜糖蛋白,具有内源性酪氨酸激酶活性。HER2/neu在25%左右的乳腺癌中过表达,与肿瘤的侵袭、转移和耐药性密切相关,导致病人生存期缩短,是肿瘤治疗的理想靶分子。TF抗原是肿瘤治疗的另一个理想的靶分子。87.5%以上的乳腺癌均高表达TF抗原,但正常组织不表达TF抗原。富含TF抗原的短小棒状杆菌能够有效治疗乳腺癌。HER2/neu是一种糖蛋白,用传统方法制备疫苗存在困难,DNA疫苗是一种很好的选择。但是,DNA疫苗的免疫原性较低,限制了DNA疫苗的发展。由于抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)在DNA疫苗的免疫应答中发挥中心作用,因此高效、特异地将DNA疫苗导入到抗原提呈细胞使抗原得到高效表达,并提高抗原的提呈效率是增强DNA疫苗免疫效果的根本途径。为提高HER2/neu DNA疫苗的免疫应答水平,我们提出以大肠杆菌菌蜕(BG)为递送载体的靶向疫苗研究策略。首先,利用BG保留了菌体抗原特性、能够被APC识别和吞噬,靶向性地将DNA靶向导入APC,增强免疫应答水平。其次,将HER2/neu基因片段与MHC-Ⅱ的分子伴侣恒定链(invariant chain, mIi)相连,这样在APC内表达的抗原表位可靶向性地进入抗原提呈通路,递呈到APC细胞表面,可以大大提高抗原提呈效率。此外,由于大肠杆菌表面富含TF抗原,因此设计的疫苗可同时针对HER2/neu及TF两个抗原对乳腺癌细胞发挥双重杀伤效应。本文正是根据这一思路进行的前期研究,主要研究内容及研究结果有：1.大肠杆菌菌蜕的制备,装载质粒DNA以及转染抗原递呈细胞采用温控的方法诱导大肠杆菌细胞裂解,离心制备BG。采用FITC标记的PNA与大肠杆菌BG孵育,流式细胞术检测其表面TF抗原含量,结果显示大肠杆菌表面TF抗原表达为阳性。流式细胞术结果显示通过调整BG与DNA的比例等参数,改进BG装载DNA的方法,可以提高装载效率。扫描电镜和透射电镜观察结果显示,BG样品保存了完整的细菌形态及内膜结构,细胞内物质已被洗去；而装载质粒DNA后,在BG中能够清晰的看到絮状DNA。使用流式细胞术检测了BG装载效率,发现接近100%的BG内均装载了质粒DNA。使用荧光标记的BG转染APC,采用流式细胞术检测BG进入APC的情况,发现几乎100%的细胞内均有BG进入。研究结果提示,BG是一种靶向性DNA载体,可高效进入APC,这对提高DNA疫苗的免疫应答水平是非常有益的。2. HER2/neu内源性靶向DNA疫苗的构建将编码小鼠恒定链mIi的序列构建到真核表达载体pVAXI中,得到含有mIi的表达载体pVAXI-mli。从人乳腺癌细胞SKBR-3中提取总RNA,采用反转录PCR方法获得HER2/neu序列。将编码HER2/neu的第一受体区序列构建到pVAXI-mli中,得到PVAXI-mIi-HER2/neu真核表达载体,这样表达产物mIi-HER2/neu就有可能直接与MHC-II分子结合,提高抗原提呈水平。此外,将HER2/neu全长序列构建到真核表达载体pCDNA3.1-EGFP-HYGRO中,获得pCDNA3.1-EGFP-HYGRO-HER2/neu用于后期转染4T1细胞。3.高表达HER2/neu和萤光素酶小鼠乳腺癌模型的建立小鼠乳腺癌4T1细胞系是研究人乳腺癌的良好动物模型,但因其Neu基因与人HER2/neu有差异,无法直接用于评价HER2/neu基因介导的免疫应答。将萤火虫萤光素酶报告基因与重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,筛选得到稳定表达HER2/neu和萤光素酶Luciferase的4T1细胞系,命名为4T1-Luc-HER2/neu.该细胞高表达人HER2/neu,适于进行HER2/neu介导的免疫学研究,而因胞内有萤光素酶基因表达,可用活体荧光成像技术实时监测移植瘤在小鼠体内生长和转移状况。4.动物实验用BG装载已构建的内源性靶向质粒DNA后,肌肉注射免疫小鼠,每周一次,共免疫四次。第四次免疫一周后,将4T1-Luc-HER2/neu细胞接种于BABL/c小鼠体内,每只1×106个。通过活体成像评价肿瘤的生长情况。实验结果显示采用BG装载的DNA疫苗免疫效果优于裸质粒,具有恒定链内源性靶向的DNA疫苗优于无恒定链的DNA疫苗。意外的是,BG本身具有非常强的免疫抑制效果,BG免疫后的小鼠对肿瘤抑制率极高。通过上述研究建立和完善了BG制备；构建了内源性靶向mIi-HER2/neu质粒；改进了BG装载质粒DNA的方法,提高了装载效率；体外实验提示BG能够高效进入APC中,有可能提高DNA疫苗的表达水平；此外,还建立了小鼠乳腺癌模型并使用该模型进行初步动物实验,证实mIi分子能够增强HER2/neu疫苗的免疫抑制效果,而大肠杆菌BG除递送功能外,有可能作为疫苗对直接对乳腺癌产生高效的杀伤效应。总之,本研究为靶向乳腺癌疫苗研究策略建立相关的技术方法、靶向载体和细胞模型,并取得初步但良好的研究结果,为后续研究提供了有利的条件。