【摘 要】
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研究背景和目的急性病毒性传染病是公共卫生面临的首要威胁。病毒,特别是RNA病毒,存在传播速度快、分子变异频繁以及潜在跨物种传播风险高等特点。因此,对于病毒引起的传染病疫情,如何快速识别病毒型别、通过病毒序列解析其感染及传播特征,对采取科学有效的防控措施具有重要意义。目前,病毒识别方法如常规的荧光定量或体外分离培养等,无法开展广谱快速检测,且需对病毒型别进行预判来设计对应的引物探针。更为重要的是,这
【基金项目】
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广东省疾病防控科技协同创新中心（2018B020207006）； 粤港澳大湾区突发急性传染病监测预警与紧急医学救援关键技术与装备的研发与示范（2019B111103001）；
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研究背景和目的急性病毒性传染病是公共卫生面临的首要威胁。病毒,特别是RNA病毒,存在传播速度快、分子变异频繁以及潜在跨物种传播风险高等特点。因此,对于病毒引起的传染病疫情,如何快速识别病毒型别、通过病毒序列解析其感染及传播特征,对采取科学有效的防控措施具有重要意义。目前,病毒识别方法如常规的荧光定量或体外分离培养等,无法开展广谱快速检测,且需对病毒型别进行预判来设计对应的引物探针。更为重要的是,这些方法无法获取病毒的序列信息,因此对其序列特征缺乏了解。本研究目的在于:①利用Nanopore测序平台,建立未知RNA病毒的快速识别方法,评估该方法在识别不同类型样本中病毒的灵敏度;②对于已知RNA病毒,特别是当前流行的新型冠状病毒,建立高样本通量的病毒全基因组测序方法,系统评估方法的灵敏度和准确性;③利用建立的未知病原识别方法及新冠病毒基因组测序方法应用到腹泻疫情的病原识别以及COVID-19复阳病例的病毒序列特征研究中,为传染病的科学防控提供重要依据。研究方法1.未知RNA病毒识别:利用随机引物扩增和连接法建库开展未知RNA病毒的Nanopore高通量测序;通过与特异的荧光定量PCR对比,评估方法的灵敏度及特异性;在此基础上进一步探索基于随机引物扩增结合快速PCR条形码的建库方法,利用不同类型的病毒株评估方法的灵敏度及特异性。2.病毒全基因组测序:以新型冠状病毒（SARS-CoV-2）为例,利用特异性引物多重PCR扩增结合Nanopore高通量测序,通过序列分析流程对测序数据进行纠错与拼接,与二代测序结果比较,评估测序及分析方法的准确性。3.应用所建立的未知RNA病毒识别方法,对2020年广东省某县诺如病毒（Norovirus,NoV）暴发疫情进行快速病原鉴定,并通过测定的病毒序列进行分子传播链分析。4.应用所建立的SARS-CoV-2全基因组测序方法,对2020年广东省新冠肺炎复阳病例样本进行全基因组扩增测序,并根据序列特征评估复阳病例的病毒学特征及传播风险。研究结果1.建立了随机引物扩增结合连接法建库的测序方法,在8小时内完成建库,12小时之内完成病原体的初步判定。将方法应用到2020年广东省一起NoV暴发疫情中,48小时内获取了 NoV的全基因组序列,提示其为新发的重组NoV型别。2.建立了随机引物扩增结合快速PCR条形码法建库的宏转录组测序方法,可在5小时内完成从样本到上机。对于呼吸道相关病毒如SARS-CoV-2和甲型流感（Influenza A virus,Flu A）,通过该方法的检测灵敏度与qPCR检测限几乎一致,对应病毒最低拷贝数分别为3.2E+03 copies/mL（cp/mL）和1.2E+03 cp/mL。对于肠道病毒EV71和CVA6,在Ct值25以内才能够获取特异病毒reads,其所对应的病毒最低拷贝数为4.0E+06 cp/mL和3.5E+07 cp/mL。3.建立了多重PCR结合Nanopore测序的SARS-CoV-2全基因组测序方法,在低病毒拷贝的样本（5.70E+03cp/mL）,仍可获得较高的测序覆盖度（＞80%）,通过分析流程比对纠错后,Nanopore测序生成的病毒一致性序列与Illumina平台的测序结果一致。研究还将此方法应用到2020年广东省新冠肺炎复阳病例样本的病毒序列测定,发现复阳病例样本中测定的病毒序列无法覆盖完整病毒基因组,提示复阳病例中可能多为排出的病毒片段,其传播风险较低。研究结论1.基于随机引物扩增结合结合不同的建库方法,通过Nanopore测序平台可以完成RNA病毒的快速识别,不同类型样本的病毒识别灵敏度存在差异。2.建立的多重PCR扩增结合Nanopore测序的病毒基因组测序方法,能够高样本通量地获取SARS-CoV-2的基因组序列,具有较高灵敏度和准确性。3.基于建立的未知病毒识别方法,可以较为全面的解析由重组诺如病毒引起的腹泻疫情,首次发现重组GII.12[P16]型诺如病毒在我国引起暴发疫情。4.基于建立病毒全基因组测序方法,分析新冠复阳病例提示病例体内可能残存病毒基因组片段,而无有完整病毒基因组。
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