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背景与目的研究表明,大多数急性髓系白血病(AML)患者初诊时骨髓原始细胞至少隐藏着一种染色体变异。其中一些染色体变异,不仅是AML亚型的诊断标志,而且还是关于完全缓解率(CR)、复发风险及总生存率(OS)的预后指标。然而,相当一部分AML患者(约40%-49%的成人和25%的儿童),通过传统的染色体分析没有发现可见的染色体异常。这部分正常核型AML(CN-AML)患者,是AML中占比例最多的亚型,通常归为预后中等组。这部分病人的预后有很大异质性,其5年生存率在不同的报告中自24%至42%不等,原因在于他们虽然没有可见的染色体异常,但基因水平可能存在不同的异常。人nucleophosmin(NPM)基因定位于5q35,全长约23 kb,含12个外显子。NPM主要定位在核仁颗粒区,也可通过核定位信号在细胞核与细胞质之间往返,参与核质间运输。国外研究发现NPM基因第12外显子突变是AML发生频率最高的一种分子遗传学改变,可出现在AML各亚型(M3除外)中,主要累及染色体核型正常的患者,发生率最高可达64%,并与疾病的发生、发展密切相关。NPM基因第12外显子的插入突变导致C-末端氨基酸残基改变,使核定位信号丢失,NPM蛋白由核仁区异常移位至胞质区。由于常规检测NPM突变的方法需PCR扩增与DNA测序先后进行,繁琐费时,为此我们参考国外报道,建立了一种简便易行的检测方法,采用免疫细胞化学法检测胞质异常定位的突变NPM蛋白,并用PCR产物测序方法,验证免疫细胞化学法的检测结果,对我院62例CN-AML患者NPM突变情况进行了初步研究。进一步结合临床资料分析其意义,初步探讨其与CN-AML的关系。对象与方法1.62例原发初诊AML患者来自2006年10月至2009年3月我院收治病例,经MIC分型确诊,另设正常对照组7例,来源于我院移植病房正常供者骨髓,染色体至少分析20个克隆为正常核型。2.病人及正常对照者骨髓细胞涂片标本应用免疫细胞化学染色法检测NPM基因突变导致NPM蛋白胞质异常定位情况。骨髓细胞涂片采用过氧化物酶标记的链霉卵白素法(S-P)检测,反应应用1:50的NPM多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG二抗,经DAB显色、苏木素复染固定封片。3.抽取患者及正常对照组肝素抗凝骨髓液2ml,Ficoll分离单个核细胞,常规酚-氯仿-异戊醇法提取DNA。基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物经凝胶回收,直接测序检测突变情况。NPM基因第12外显子扩增引物:上游引物:5′-CAAGACTATTTGCCATTCCTAAC-3′,下游引物5′-TTAACTCTCTGGTGGTAGAATGAA -3′,扩增产物为560bp。反应设立内参照β-actin:上游引物:5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′,下游引物:5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′,扩增产物为268bp。PCR反应体系50μl:包括Taq酶2.5μl,20μM上下游引物各1μl,dNTP100nmol,10×PCR Buffer 5μl,基因组DNA 1μg,补水至50μl反应体系。反应条件:95℃10min;95℃30s,55℃45s,72℃1min,35个循环:72℃10min。结果1.免疫细胞化学法:62例原发初诊正常核型AML患者中共检出胞质定位的NPM蛋白18例(29.0%),7例健康对照者均未发现胞质NPM蛋白。2.基因组DNA PCR产物测序法:检出相应的18例患者发生突变,15例患者为A型突变,3例患者为B型突变。两种检测方法结果完全一致。3.NPM突变与临床特征的关系(见表一):NPM突变组与未突变组相比,患者发病时的白细胞数、血红蛋白量、血小板计数、骨髓原始细胞比例及淋巴结肿大、肝脾肿大、牙龈增生、皮肤浸润差别无显著性(P＞0.05);突变组患者的年龄集中于40～60岁;性别以女性为多,男女比例1:1.6。4.NPM突变与临床疗效的关系:经两周期标准DA或HA方案诱导缓解,18例NPM突变患者中16例获得完全缓解(88.9%),而其余44例患者中28例获得完全缓解(63.6%),两组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论1.NPM突变是CN-AML患者一个重要的分子预后标志,NPM突变提示CN-AML患者临床预后较好。2.我们建立的免疫细胞化学染色法为CN-AML患者NPM突变提供了简单易行,稳定可靠的检测方法。