糖苷水解酶是水解碳水化合物中糖苷键的一类酶,在自然界中广泛存在,并且在食品、医疗、再生能源工业等方面具有重要应用。本实验室前期筛选了一株纤维单胞菌Cellulosimicrobium sp.TH-20,研究发现该菌株对纤维素、木聚糖及人参皂苷等多种聚合物具有降解及转化活性,实验室已经对该菌株进行了基因组测序,本论文基于基因组注释信息围绕Cellulosimicrobium sp.TH-20的六个糖苷水解酶进行了相关研究。主要的实验结果如下:1.从Cellulosimicrobium sp.TH-20中选择了六个糖苷水解酶基因进行克隆并构建重组质粒,将其在大肠杆菌中异源表达,利用亲和层析对重组酶进行了纯化,将获得的六个纯酶组分分别命名为CAgl13、CXyl3、CAbf51、CMal65、CAmy13和CGH43。2.CAgl13的序列分析显示该酶为GH13家族的α-淀粉酶,酶学性质检测结果显示其最适反应温度为40℃,在30℃以下具有较好的热稳定性;最适反应pH为磷酸盐缓冲液pH8.0,在pH5.0-12.0之间pH稳定性较好;底物特异性广泛,可以水解pNPβGlu、pNPαGlu、pNPβGal、pNPαArap、麦芽寡糖和淀粉,同时对麦芽糖还具有转糖苷活性,是一个以α-葡糖苷酶活性为主的多功能酶;水解产物葡萄糖对酶活有抑制作用,2.5 M的葡萄糖使酶的剩余活性约为原活力的40%;动力学分析表明米氏常数K_m为6.82mM,K_cat为0.07 s^-1,催化效率K_cat/K_m为0.01s^-1mM^-1;1 mM的Fe³⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺对酶活性有抑制作用,高浓度的Mg²⁺、Mn²⁺和Na⁺对酶活性有促进作用,高浓度的Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺和Cu²⁺抑制酶活;1%的甲醇和乙醇对酶活性没有影响,10%的甲醇和乙醇对酶活性有抑制作用,丙醇和甘油对酶活性有促进作用,丁醇、EDTA、SDS、N-乙酰咪唑、碘乙酸、TritonX-100和Tween80对酶活性有抑制作用。3.CXyl3的序列分析显示该酶为GH3家族的β-葡糖苷酶,但底物特异性结果显示该酶能够水解pNPβXyl、pNPαAraf、pNPαArap和pNPβGal,对pNPβXyl的活性最高,是以β-木糖苷酶活性为主的多功能酶。以pNPβXyl为底物对CXyl3的酶学性质进行了检测,结果显示酶的最适反应温度为40℃,在40℃以下具有较好的热稳定性;最适反应pH为磷酸盐缓冲液pH7.0,在pH6.0-11.0之间pH稳定性较好;水解产物木糖对酶活有抑制作用,2.5 M的木糖使酶的剩余活性约为原活力的30%;动力学分析表明其米氏常数K_m为1.47 mM,K_cat为0.11 s^-1,催化效率K_cat/K_m为0.07 s^-1mM;1mM的Fe²⁺、Na⁺和K⁺对酶活性无影响,1mM的Mn²⁺、Zn²⁺、Fe^3+、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺和Co²⁺对酶活性有抑制作用,10mM的Na⁺、Mn²⁺、Mg²⁺对酶活性有促进作用,10mM的Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Fe²⁺和Zn²⁺对酶活性有抑制作用;乙醇、丙醇、丁醇、TritonX-100和Tween80对酶活性有抑制作用,β-巯基乙醇、SDS、N-乙酰咪唑和碘乙酸对酶活性有抑制作用。4.CAbf51的序列分析显示该酶为GH51家族的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶,酶的最适反应温度为60℃,在40℃以下具有较好的热稳定性;最适反应pH为磷酸盐缓冲液pH7.0,在pH6.0-9.0之间pH稳定性较好;底物特异性广泛,能够水解pNPαAraf、pNPβXyl和pNPβGal,同时还可以水解阿拉伯寡糖释放阿拉伯单糖;水解产物阿拉伯糖对酶活性有促进作用,2.5 M的阿拉伯糖使酶活提高至原活力的130%;动力学分析表明其米氏常数K_m为3.07 mM,K_cat为0.02 s^-1,催化效率K_cat/K_m为0.01 s^-1mM^-1;1 mM的Fe²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺对酶活性有促进作用;1 mM的Co²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺对酶活性有抑制作用,10 mM的Mg²⁺和Na⁺对酶活有促进作用,10 mM的K⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Zn²⁺Fe³⁺和Cu²⁺对酶活有抑制作用;乙醇、丙醇和甘油对酶活性有促进作用,丁醇、β-巯基乙醇、SDS、N-乙酰咪唑和碘乙酸对酶活性有抑制作用。5.CMal65、CAmy13和CGH43的序列分析结果显示分别为GH65家族的麦芽糖磷酸化酶,GH13家族的α-淀粉酶和GH43家族的糖苷水解酶,以pNP底物对其进行酶活测定,结果显示CMal65只对pNPβGal有微弱的活性;CAmy13和CGH43对目前检测的p NP底物均没有水解活性,需要进一步研究。本论文重组表达的糖苷水解酶在序列上具有新酶特征,其深入研究将有利于Cellulosimicrobium sp.TH-20水解机制的阐明,并为糖苷水解酶相关的工业应用提供新的潜在酶源。