产橙皮苷酶菌株的筛选及发酵提取耦合制备橙皮素单葡萄糖苷的研究

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橙皮素单葡萄糖苷(HMG)是由橙皮苷脱去一分子鼠李糖形成的,生理活性与橙皮苷相似,在水中的溶解度和吸收利用率比橙皮苷更高。本文筛选高产橙皮苷酶的发酵菌株,并对菌株的发酵条件和提高橙皮素单葡萄糖苷得率的发酵方法进行了研究。从常年生产橙皮苷工厂的土样中筛选得到1株能够降解橙皮苷产生橙皮素单葡萄糖苷的菌株,经过显微形态观察和18SrDNA序列分析,鉴定该菌株为肉座菌目雪腐镰刀菌(Fusarium nivale),并保存于中科院微生物研究所,保藏编号:6238。雪腐镰刀茵6238发酵酶解橙皮苷产物的鉴定结果是橙皮素单葡萄糖苷和橙皮素的混合物,表明其所产橙皮苷酶包括a-L-鼠李糖苷酶和B-D-葡萄糖苷酶两种,可将橙皮苷水解为橙皮素单葡萄糖苷,并进一步降解为橙皮素。以雪腐镰刀菌6238为发酵菌株,研究了碳源、氮源、无机盐及橙皮苷添加量、菌种接种量、发酵温度、发酵pH值等条件对雪腐镰刀茵6238产酶酶活的影响,并采用响应面法对各发酵条件进行了优化。结果表明:以蔗糖为碳源,添加量为30g/L;酵母膏为氮源,添加量为3g/L;K2HPO4为无机盐,添加量为1g/L;橙皮苷添加量为3%;接种量6%(v/v),温度30℃,pH6,转速158r/min,a-L-鼠李糖苷酶酶活最高可达到95.6U/ml。通过对不同极性的树脂进行筛选,选择对橙皮素单葡萄糖苷具有良好的吸附和分离能力的树脂;同时,研究不同的吸附、洗脱条件对橙皮素单葡萄糖苷纯化的影响。结果表明:大孔树脂HPD100对橙皮素单葡萄糖苷具有较强的吸附和解析能力;在50%的乙醇溶液、2BV/h的流速作为洗脱条件下,发酵酶解产物橙皮素单葡萄糖苷和橙皮素能较好分离。将发酵罐与大孔树脂分离柱连接制备橙皮素单葡萄糖苷,研究了不同的条件对橙皮素单葡萄糖苷得率的影响。结果表明:发酵-酶解-提取耦合的方法能够提高橙皮素单葡萄糖苷的得率,在发酵液回流速度为3BV/h的条件下,橙皮素单葡萄糖苷得率可由原来的13.3%提高至48.3%。本研究工作筛选得到1株高产橙皮苷酶的菌株;并采用发酵-酶解-提取耦合的方法制备橙皮素单葡糖糖苷,显著提高了橙皮素单葡萄糖苷的得率,为提高柑橘黄酮的附加值提供一种较为可行的方法。
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