背景：　　皮肤鳞状细胞癌（cutaneoussquamouscellcarcinoma,CSCC）简称皮肤鳞癌，是最常见的皮肤恶性肿瘤之一，在非黑素细胞肿瘤性皮肤肿瘤中发病率仅次于基底细胞癌，且发病率呈逐年上升的趋势。CSCC可发生于任何部位的皮肤或黏膜，常发生在某些原有皮肤病的癌前疾病的基础上，或由各种癌前期疾病演变而来，少数亦可为原发性皮肤鳞癌。CSCC临床表现为浸润性斑块、结节、溃疡或疣状增生，具有局部侵袭、复发和淋巴及远处转移的特征，甚至可引起死亡。CSCC的病理表现为起源于鳞状上皮细胞的肿瘤巢，伴有不同程度的细胞分化，可侵入真皮或更深的组织。高分化的细胞表现为大的、泡沫状细胞核或有一个或多个细胞核和大量嗜酸性细胞质，单个细胞的角化或肿瘤细胞癌巢内形成角珠是CSCC的特征性标志。目前CSCC主要的治疗方法有Mohs显微描记手术(Mohsmicrographicsurgery)、化疗、光动力治疗、放射治疗、生物治疗和免疫治疗等，治疗方式的选择应根据病灶的大小、部位、临床表现、组织病理分级、患者一般情况、患者年龄和病灶类型、原发、复发以及转移等因素进行选择。对病灶较小、分化良好且没有淋巴结及远处转移的CSCC首选Mohs显微描记手术治疗，切除范围至少在瘤体外方0.5～2cm，并需要足够的深度，术中快速冰冻切片有助于肿瘤的彻底切除，较小的皮损可以直接切除缝合，较大的皮损可以应用局部带蒂皮瓣移植术，或考虑植皮术。老年体弱、有手术禁忌症以及头面部结缔组织不多的部位的肿瘤，特别是在肿瘤分化差、肿瘤侵犯骨骼、软骨或已有淋巴结转移的情况下，不适宜行手术治疗，应选择放射治疗或其他治疗。虽然近年来随着诊疗技术的提高和治疗方法的不断改进，CSCC患者的早期诊断率和临床治愈率大为提高，但较大皮损及转移患者的治疗仍是临床治疗的难点。因此对CSCC的发生机制、早期诊断和预防治疗是当前皮肤肿瘤研究的热点课题。　　肿瘤是一种基因病，其发病是一个多因素、多阶段、复杂渐进的过程，肿瘤发生是长期的、多步骤、多阶段、多种基因突变积累的结果，肿瘤细胞来自于正常细胞，但是肿瘤细胞具有超过正常的增殖能力，增生与机体不相协调，失去控制。关于微小RNAs(microRNAs，miRNAs)的研究提示miRNA在肿瘤发病中起到不可忽视的作用。miRNAs是近年来发现的一类长度约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，参与细胞的生长、分化、增殖、凋亡、个体发育、机体代谢等生理过程，miRNAs的异常表达与多种肿瘤的关系密切。微小RNA21（microRNA-21，miR-21）是目前发现的唯一一种在多个系统多种实体肿瘤中及血液系统非实体肿瘤中高表达的miRNA，也是第一个在肿瘤病人血清中检测到的miRNA，其在肿瘤中的表达异常及其对靶基因的抑制作用在人类miRNAs功能学的研究中不可忽视。　　miR-21通过与靶基因mRNA的3UTR结构相结合，抑制靶基因的表达，发挥其各种重要的功能。miR-21靶基因应具有下述3个特征:1.靶基因的表达水平与miR-21表达水平相反，miR-21高表达时靶基因低表达，反之miR-21低表达时靶基因高表达;2.靶基因有miR-21的结合的互补结合位点，能够结合miR-21，当miR-21过度表达或低表达时，荧光素酶报告实验构建该基因的3UTR有相应变化;3.miR-21靶基因结合位点缺失或突变时，miR-21不能发挥抑制靶基因表达的作用。miR-21通过对靶基因的调控调节细胞的分化、增殖和凋亡，参与肿瘤细胞的侵袭、血管浸润和转移。在众多的靶基因中，程序性细胞死亡因子4(programmedcelldeath4，PDCD4)和第10号染色体同源丢失性磷酸酶基因和张力蛋白基因(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometengene，PTEN)都是在肿瘤发生发展中具有重要功能的miR-21的靶基因。PDCD4不仅在细胞程序性死亡过程中起重要调节作用，而且通过抑制蛋白翻译过程对肿瘤细胞的生长进行抑制。作为细胞凋亡的关键细胞因子，PDCD4通过多条信号通路参与、通过众多癌基因的作用抑制肿瘤的转化、抑制肿瘤的进展和转移。PTEN是迄今为止发现的第一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，通过负调控磷酸肌醇-3-激酶/丝氨酸激酶信号通路在细胞的生长、增殖、迁移和细胞凋亡中具有重要的生物学功能，影响肿瘤细胞的浸润、转移和骨架蛋白的组装，基因丢失、突变和/或降低表达引起的PTEN功能缺失已在多数肿瘤中发现。PDCD4和PTEN作为肿瘤抑制因子，可以抑制细胞的恶性转化，阻止肿瘤发生，在多种肿瘤细胞中下调或缺失，在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用。程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)，又称为细胞凋亡（apoptosis），在很多肿瘤细胞中细胞凋亡的程序被打破，DNA发生损伤或突变，发生细胞凋亡不足，从而导致细胞生存期延长，增殖不受限制。肿瘤是细胞凋亡异常的疾病，肿瘤细胞存在细胞增殖和分化异常，肿瘤的发生既有细胞增殖的加速的原因，细胞死亡的减缓也起到重要作用，细胞失去控制的生长，凋亡不及，细胞数失去相对恒定导致肿瘤发生。近年来的研究发现miR-21在多种肿瘤中表达上调，肿瘤细胞凋亡出现异常，miR-21的靶基因PDCD4和PTEN在肿瘤中也存在表达异常。然而目前关于皮肤鳞癌发病过程中miR-21、其靶基因的作用及其对皮肤鳞癌肿瘤细胞凋亡的研究甚少。反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)是采用人工合成碱基序列与靶基因或mRNA某一区段互补的核酸片段，可以通过碱基互补原则结合于靶基因或mRNA，改变特定蛋白的表达。　　为探讨miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN在皮肤鳞癌发病中的作用，本研究检测了皮肤鳞癌组织及A431细胞株的miR-21的表达，皮肤鳞癌组织和A431细胞中miR-21的靶基因PDCD4和PTEN的蛋白表达水平及表达部位，同时采用反义寡核苷酸技术对培养的A431细胞进行miR-21的抑制，再检测miR-21的靶基因PDCD4和PTEN的蛋白表达水平，并进行细胞凋亡的检测。通过对miR-21及其靶基因在皮肤鳞癌组织及细胞株中表达的研究，试图阐明miR-21的靶基因PDCD4和PTEN在皮肤鳞癌发生、发展中的作用和意义，为皮肤鳞癌的基因治疗提供试验依据和基础。　　本实验研究共分为以下两部分。　　第一部分miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN蛋白在皮肤鳞癌组织中的表达　　目的：　　检测miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN在CSCC及正常皮肤组织中的表达，了解miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN在CSCC及正常皮肤组织中表达的差异，探讨miR-21及其靶基因PDCD4和PTEN表达异常在CSCC发病机制中的作用及意义。　　方法：　　1.选择2010年7月至2012年4月皮肤性病科经病理确诊的CSCC组织标本18例，整形外科手术切除的正常皮肤组织标本18例。　　2.采用荧光定量RT-PCR方法检测miR-21在18例CSCC和18例正常皮肤组织中的表达水平。　　3.采用Westernblot和免疫组织化学方法检测18例CSCC组织和18例正常皮肤组织中PDCD4和PTEN的表达情况。　　4.分析miR-21的表达和CSCC的临床分期及组织分化程度的关系。　　结果：　　1.CSCC组织中miR-21表达高于正常皮肤组织，两种组织表达差异有统计学意义（t=10.644，P＜0.001）。MiR-21表达与CSCC的发病年龄、性别的差异均无统计学意义（P＞0.05），而与肿瘤分期及病理分级的差异有统计学意义（P＜0.05）。　　2.Westernblot方法检测CSCC组织中PDCD4的灰度相对定量值为0.692±0.072，比正常皮肤组织中PDCD4的灰度相对定量值1.018±0.045低（t=-11.522，P＜0.05）。免疫组织化学方法检测正常皮肤组织中PDCD4蛋白呈高表达，阳性染色定位于细胞浆和细胞核;CSCC组织中PDCD4蛋白呈低表达或不表达，阳性染色主要定位于细胞浆。CSCC组织PDCD4蛋白表达低于正常皮肤组织，两种组织表达差异具有统计学意义(Z=-3.573，P＜0.001)。　　3.Westernblot方法检测CSCC组织中PTEN的灰度相对定量值为0.493±0.141，比正常皮肤组织中PTEN的灰度相对定量值0.977±0.029低(t=-10.047，P＜0.05)。免疫组织化学方法检测正常皮肤组织中PTEN蛋白呈高表达，阳性染色定位于细胞浆和细胞核;CSCC组织PTEN蛋白呈低表达或不表达，阳性染色主要定位于细胞浆。CSCC组织PTEN蛋白表达低于正常皮肤组织，两种组织表达差异具有统计学意义(Z=-3.237，P＜0.05)。　　小结：　　1.miR-21在CSCC组织中呈高表达，其表达水平与肿瘤分期及病理分级的差异有关。　　2.miR-21的靶基因PDCD4及PTEN蛋白在CSCC组织中呈低表达或不表达，阳性染色主要定位于细胞浆。　　第二部分反义抑制miR-21对其靶基因PDCD4和PTEN蛋白表达及细胞凋亡在皮肤鳞癌A431细胞株中的影响　　目的：　　探讨反义抑制miR-21对其靶基因PDCD4和PTEN在CSCCA431细胞株中表达的影响及对细胞凋亡的影响，探讨miR-21对CSCC发病机制的作用及反义抑制miR-21在CSCC治疗中的意义。　　方法：　　1.A431细胞分为Cell组:未转染的A431细胞;NC组:转染无关序列的A431细胞;AS-ODN组:转染miR-21AS-ODNA431细胞。　　2.采用荧光定量RT-PCR检测miR-21在各组细胞中的表达水平。　　3.采用Westernblot和免疫细胞化学方法检测各组细胞中PDCD4和PTEN的表达情况。　　4.采用TUNEL检测转染前后A431细胞株中细胞凋亡情况。　　结果：　　1.转染miR-21抑制物后皮肤鳞癌细胞株A431中miR-21表达下降，Cell组为1.00±0.06、NC组为0.98±0.77、AS-ODN组为0.42±0.01，三组表达有差异(F=107.24，P＜0.05)，Cell组和NC组比较差异无统计学意义（P＞0.05），Cell组和AS-ODN组、NC组和AS-ODN组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。　　2.转染miR-21抑制物后A431细胞株中PDCD4和PTEN的表达增强。Westernblot检测三组细胞中PDCD4表达的灰度相对定量值Cell组为1.021±0.035、NC组为0.979±0.061，AS-ODN组为1.827±0.023，差异有统计学意义(F=119.13，P＜0.05)，转染miR-21抑制物后A431细胞中PDCD4表达增加。三组细胞中PTEN表达表达的灰度相对定量值Cell组为1.014±0.052、NC组为0.985±0.027，AS-ODN组为2.554±0.034，差异有统计学意义(F=249.64，P＜0.05)，转染miR-21抑制物后A431细胞中PTEN表达增加。　　3.免疫细胞化学方法检测PDCD4在细胞核以及细胞浆均有表达，cell组以及NC组染棕褐色，均少量表达，AS-ODN组染棕褐色，强表达。PTEN在细胞核以及细胞浆均有表达，cell组以及NC组染棕黄色，均少量表达，AS-ODN组染棕褐色，强表达。　　4.转染miR-21抑制物后A431细胞株中PDCD4和PTEN的表达增强。免疫细胞化学法PDCD4表达Cell组为62340.03±2157.52、NC组为55871.36±7281.27，AS-ODN组为175302.34±14571.90，三组表达差异有统计学意义(F=50.12，P＜0.05)，Cell组和NC组比较差异无统计学意义（P＞0.05），Cell组和AS-ODN组、NC组和AS-ODN组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。PTEN表达Cell组为19206.26±655.01、NC组为19149.26±1058.29，AS-ODN组为135572.92±4685.05，三组表达差异有统计学意义(F=576.54，P＜0.05)，Cell组和NC组比较差异无统计学意义（P＞0.05），Cell组和AS-ODN组、NC组和AS-ODN组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。　　5.转染miR-21抑制物后A431细胞株中细胞凋亡率较Cell组和NC组增加（图3），细胞凋亡率Cell组为0.10±0.02、NC组为0.13±0.01，AS-ODN组为0.36±0.03，三组表达差异有统计学意义(F=201.79，P＜0.05)，Cell组和NC组比较差异无统计学意义（P＞0.05），Cell组和AS-ODN组、NC组和AS-ODN组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。　　小结：　　1.转染Anti-miR-21后A431细胞株中miR-21表达下降，表明miR-21AS-ODN可成功抑制A431细胞株中miR-21的表达。　　2.反义抑制miR-21后A431细胞株中PDCD4的表达比反义抑制前增高，反义抑制miR-21后A431细胞株中PTEN的表达比反义抑制前增高。　　3.反义抑制miR-21后A431细胞株中凋亡细胞比例比反义抑制前增高。　　结论：　　1.miR-21在CSCC组织中呈高表达，其表达和肿瘤的临床分期及分化程度相关。　　2.miR-21靶基因PDCD4P和TEN蛋白在CSCC组织中呈低表达，阳性染色主要定位于细胞浆。　　3.转染Anti-miR-21后A431细胞株中miR-21表达下降，成功构建抑制miR-21的A431细胞株。　　4.反义抑制miR-21可以上调A431细胞株中PDCD4和PTEN蛋白的表达。　　5.反义抑制miR-21可以促进肿瘤细胞凋亡。