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背景与目的癫痫(epilepsy,EP)是由多种原因引起的,以反复出现神经元异常放电所致的短暂性脑功能障碍为特征的一组病变。长期、反复发作的癫痫严重影响着患者的生活和工作,也给家庭,社会带来了较大的负面影响。癫痫发病机制的复杂性,使得至今尚未能了解其全部机制,因而进一步明确癫痫的发病机理及寻求新的诊治靶点具有重要意义。线粒体具有为细胞生理活动提供能量和调控信号传导等重要作用。因此近年来成为癫痫发病机制的研究热点。以往研究经证实癫痫发作可使线粒体功能受损,造成大量的变性蛋白质和受损细胞器堆积在细胞内。同时使损伤的线粒体膜电位降低,并发生通透性转运,释放凋亡相关因子,最终引起细胞凋亡,形成神经元对癫痫损伤更加敏感的恶性循环。因此,及时清除受损线粒体和维持线粒体正常功能显得至关重要。线粒体移动在清除受损线粒体和维持线粒体正常功能中发挥重要作用:线粒体移动可将受损线粒体逆行运动至胞体被降解和回收,同时将正常线粒体顺向运动至神经元的作用部位而发挥功能,以保证病理状态下线粒体在细胞中占领正确的位置及分布,来应对病理损伤。然而,关于线粒体是如何移动的机制并不明确,一些相关研究证实存在一部分与线粒体移动密切相关联蛋白质分子,如为线粒体移动提供驱动力的马达分子Kinesin(驱动蛋白)、Dynein(动力蛋白)和Myosin(肌球蛋白);将马达分子与线粒体相连的衔接蛋白如Miro1/2(mitochondrial Rho-GTPase 1/2)、Milton和Syntabulin。Miro蛋白是小GTPase家族中的一员,它的N端和C端各有一个GTPase结构域,同时含有与Ca2+相结合的EF手型结构域,其通过C端跨膜区域与线粒体定向结合。以往研究发现,Miro可与Milton形成复合物,然后与Kinesin肌球重链(KHC)连接,进而调控线粒体沿微管的快速移动。目前,大量国内外研究证实癫痫过程中存在线粒体功能及结构损伤。但线粒体移动异常在癫痫神经元线粒体功能结构受损中发挥何种作用;能否通过调控线粒体移动而发挥神经保护作用仍然未知。因此,本课题在前期实验的基础上,通过体外原代培养海马神经元及无镁诱导建立癫痫放电模型,同时构建腺病毒真核表达质粒干预Miro1表达,通过观察Miro1介导的线粒体移动对无镁致痫的海马神经元细胞形态、细胞活性、神经元损伤和凋亡的影响,探讨是否通过调控线粒体移动,减少线粒体损伤,抗凋亡级联发挥癫痫神经保护作用,并通过检测神经元中Bax、caspase-3及Bcl-2表达水平的变化,初步探讨其中的可能机制。材料与方法取新生24h内Sprague-Dawley大鼠,75%酒精浸泡消毒后,断头取脑,分离双侧海马组织,制成单细胞悬液,体外进行大鼠海马神经元的原代培养。于倒置相差显微镜下观察海马神经元在培养过程中的形态学变化,选取培养至10d的神经元细胞,采用免疫荧光的方法进行神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)神经元纯度鉴定。同时构建表达大鼠Miro1基因的重组腺病毒真核表达质粒(r Ad-Miro1)以及不表达任何外源基因的对照腺病毒载体(r Ad),并鉴定。取培养至14d的海马神经元随机分为对照组(CON组)、无镁诱导组、无镁诱导+r Ad转染组、无镁诱导+r Ad-Miro1转染组四组,后三组按照Sombati细胞模型方法,进行无镁细胞外液处理3h后恢复至正常细胞培养液,其中无镁诱导+r Ad转染组、无镁诱导+r Ad-Miro1转染组在无镁细胞外液诱导前48h分别转染r Ad及r Ad-Miro1进行预处理。造模成功24h后通过MTS试剂盒分别测定各组海马神经元细胞活性变化,取各组中部分细胞采用TUNEL法检测神经元凋亡情况,剩余细胞采用QT-PCR法测定Miro1 m RNA的表达,Western blot法检测Miro1、Bax、Bcl-2及Caspase 3的表达。结果1.细胞形态学观察:倒置差相显微镜下可观察到刚种植于细胞培养板内的大鼠海马神经元为较小体积的单个细胞,呈圆形,饱满,透亮,且散在分布。部分神经元细胞在培养3h后开始贴壁,几乎所有的神经元细胞培养至24h后均贴壁生长,并且有明显的长短不一的突起长出。培养至7d时,典型的神经元轴突与树突即可被观察到,且胞体立体感强,细胞核呈空泡状,但神经元与神经元之间尚未形成突触,大多为单个细胞。培养至10d左右大鼠海马神经元之间开始形成网状联系。培养至14 d时神经元胞体最大,轴突、树突清晰,细胞间网络变得密集。培养至至4w时,维持液中开始有大量细胞碎片出现,细胞逐渐凋亡。2.海马神经元纯度鉴定:取培养至10d的海马神经元细胞爬片,采用免疫荧光细胞化学方法进行鉴定,结果显示:海马神经元纯度达93.1%。3.神经元活性测定:MTS试剂盒测定细胞活性结果显示,与CON组相比,无镁诱导组、无镁诱导+r Ad转染组、无镁诱导+r Ad-Miro1转染组三组大鼠海马神经元细胞活性下降,差异均具有统计学意义;与无镁诱导组相比,无镁诱导+r Ad-Miro1转染组海马神经元细胞活性升高,差异有统计学意义,无镁诱导+r Ad转染组海马神经元细胞活性下降,差异无统计学意义。4.病理学检测:TUNEL法结果显示,与对照组相比,无镁诱导组、无镁诱导+r Ad转染组、无镁诱导+r Ad-Miro1转染组3组中凋亡的大鼠海马神经元中数目增多,差异有统计学意义;与无镁诱导组相比,无镁诱导+r Ad-Miro1转染组凋亡的大鼠海马神经元数目减少,差异有统计学意义,无镁诱导+r Ad转染组凋亡的大鼠海马神经元数目增多,差异无统计学意义。5.QT-PCR结果:与CON组相比,无镁诱导组、无镁诱导+r Ad转染组、无镁诱导+r Ad-Miro1转染组三组大鼠海马神经元无镁诱导后24h Miro1 m RNA水平显著升高,差异有统计学意义;与无镁诱导组相比,无镁诱导+r Ad-Miro1转染组,Miro1 m RNA水平升高,差异有统计学意义;无镁诱导+r Ad转染组Miro1 m RNA水平升高,差异无统计学意义。6.Western blot结果:与CON组比较,Miro1蛋白表达量在无镁诱导后3h开始升高,24h时达最高水平,差异有统计学意义;与CON组比较,无镁诱导组、无镁诱导+r Ad转染组和无镁诱导+r Ad-Miro1转染组三组大鼠海马神经元无镁诱导后24h Miro1水平均显著升高,Bcl-2表达下降,caspase-3和Bax的激活均明显增加,差异具有统计学意义;与无镁诱导组相比,无镁诱导+r Ad-Miro1转染组Miro1水平均升高,差异具有统计学意义;无镁诱导+r Ad转染组Miro1水平升高,差异无统计学意义;无镁诱导+r Ad-Miro1转染组Bcl-2表达升高,Bax和caspase-3激活减少,差异均具有统计学意义,无镁诱导+r Ad转染组Bcl-2表达升高,Bax和caspase-3激活减少,差异均无统计学意义。结论1.无镁诱导大鼠海马神经元致痫后细胞内Miro1 m RNA及Miro1蛋白的表达水平均提高,提示线粒体移动可能参与癫痫病理损伤的过程;2.Miro1蛋白介导的线粒体移动对癫痫发作后的大鼠海马神经元具有保护作用,其机制可能与及时清除受损的线粒体,抑制Bax和caspase-3表达,提高Bcl-2表达,进而发挥抑制线粒体凋亡途径的作用有关;3.调控线粒体移动可成为抗癫痫治疗的新思路和方法。