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目的:初步了解磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)在急性发作期哮喘患者外周血T淋巴细胞中的蛋白表达情况,并观察利用PI3K特异性抑制剂LY294002阻断体外培养对急性哮喘患者及健康人外周血T淋巴细胞周期分布的影响,以探讨PI3K参与T细胞过度活化增殖在哮喘发病机制中的作用。
方法:(1)病例采集及提纯T淋巴细胞:收集2008年9月至2009年2月间20例急性发作期哮喘患者(男性12例,女性8例,平均年龄30±9.6岁)作为实验组,15例健康人(男性9例,女性6例,平均年龄28±8.9岁)为健康对照组。每一研究对象于清晨空腹时,无菌肝素抗凝抽取静脉血5ml(哮喘患者于使用激素前),Ficoll密度梯度离心法提取获得PBMC,尼龙毛柱法提纯T淋巴细胞;(2)用Western blotting法检测哮喘患者T淋巴细胞中PI3K Y蛋白的表达水平:将对数生长期的T淋巴细胞分为哮喘组(A组)、对照组(B组),再将哮喘组随机分为3组,分别进行检测;(3)用MTT法观察T淋巴细胞增殖情况:将对数生长期的哮喘患者的T淋巴细胞及正常人的T淋巴细胞分为A组(正常人不加LY294002组)、B组(正常人加LY294002组)、C组(哮喘不加LY294002组)、D组(哮喘加LY294002组),在培养24、48、72、96h后测定细胞增殖率;(4)用流式细胞仪检测细胞周期的时相分布:将对数生长期的哮喘患者的T淋巴细胞及正常人的T淋巴细胞分为E组(哮喘加LY294002组)、F组(哮喘不加LY294002组)、G组(正常人不加LY294002组),流式细胞仪检测G0/G1期、S期分布。
结果:(1)Western blotting方法检测哮喘组与对照组T淋巴细胞中磷酸化PI3Ky蛋白表达,结果显示,与正常人相比,急性哮喘发作期患者外周血T淋巴细胞中的PI3Ky蛋白表达水平显著上调。正常对照组外周血T淋巴细胞中PI3Ky蛋白表达较低(10945±960),哮喘组(20079±838.7),表达差异显著,有统计学意义(P<0.01);3个哮喘组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)MTT结果显示:在24h点,A组增殖率(0.309±0.088)、B组增殖率(0.272±0.014)、C组增殖率(0.630±0.051)、D组增殖率(0.470±0.050);在48h点A组增殖率(0.269±0.005)、B组增殖率(0.230±0.013)、C组增殖率(0.565±0.040)、D组增殖率(0.435±0.052);在72h点A组增殖率(0.309±0.009)、B组增殖率(0.272±0.014)、C组增殖率(0.627±0.051)、D组增殖率(0.473±0.050);在96h点A组增殖率(0.274±0.007)、B组增殖率(0.245±0.010)、C组增殖率(0.587±0.046)、D组增殖率(0.410±0.041);在24、48、72、96h时间点,A、B、C、D四组间进行组间比较,除A组与B组间差异无统计学意义以外(P>0.05),其余各组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)将E组、F组、G组的T淋巴细胞,用流式细胞仪检测细胞周期的时相分布。结果显示:E组G0/G1期分布比例为91.85%±7.63%,F组G0/G1期分布比例为77.40%±6.42%,G组G0/G1期分布比例为99.25%±0.01%,各组间的G0/G1期分布比例比较,差异有统计学意义(P<0.05);E组S期分布比例为5.21%±2.33%,F组S期分布比例为19.73%±10.63%,G组S期分布比例为0.046%±0.076%,各组间S期分布比例比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:PI3K信号转导途径活化参与了哮喘的免疫学发病机制,并在哮喘发作的T淋巴细胞增殖及细胞周期异常中起重要作用。