[目的]1.采用小鼠自由饮用DSS溶液法构建炎症性肠病急、慢性动物模型,为脐带间充质干细胞(UCMSC)治疗IBD的疗效与机制研究提供实验对象。2.评价不同来源UCMSC、不同途径注入的UCMSC对炎症性肠病的疗效和机制,为UCMSC临床治疗IBD提供理论依据和方法。[方法]1、UCMSC的制备:1.KM小鼠UCMSC:取KM孕鼠3只,采用颈椎脱臼法处死,剖腹,取脐带,剔除被膜、血液等;剪成体积小于1mm3组织块,接种于T25培养瓶底,置于5%C02培养箱内。待UCMSC生长至80%-90%融合时,按1:3传代。2.人UCMSC:由干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室提供的P2代细胞,按1:3传代。分别对人和鼠P3UCMSC进行流式细胞仪分析UCMSC标志抗原阳性表达率,分析UCMSC成骨、成脂、成软骨分化能力。将P3细胞用冻存液稀释成3×106/mL,液氮贮存备用。使用时,用生理盐水将 UCMSC 稀释成 5×106/ml 和 1×107/ml。2、IBD动物模型的建立:①急性模型:健康雄性C57BL/6小鼠(鼠龄:7-8w;体重20-22g)自由饮用3%DSS水溶液七天后,处死小鼠取材。②慢性模型:小鼠自由饮用3%DSS溶液5天,间隔10天后,按照“每隔三天持续饮用DSS溶液4天”循环5次后,处死小鼠并采集相关标本。造模期间,每天监测小鼠体重、粪便形态、便血以及死亡率等指标;造模结束后,对结肠组织进行HE染色,观察结肠组织学变化,同时行组织病理学评分。3、UCMSC移植治疗小鼠IBD(1)不同途径注射人UCMSC治疗急性IBD模型:按上述方法制作急性IBD模型36只,将其随机平均分成模型组、腹腔注射UCMSC组、静脉注射UCMSC组,每组12只,同时设正常对照组9只。UCMSC静脉注射组和腹腔注射组分别在造模开始后的第1、3、5天注射浓度为5×106/ml的UCMSC悬液100ul,模型组同步注入等量生理盐水。于造模开始后的第七天处死小鼠取材。(2)UCMSC治疗慢性IBD模型:取健康雄性C57BL/6小鼠,按上述方法制作急性IBD模型45只,然后将其随机平均分成模型组、鼠UCMSC组、人UCMSC组,每组15只;同时设正常对照组9只。鼠UCMSC治疗组和人UCMSC治疗组经腹腔分别注射鼠UCMSC与人UCMSC(细胞浓度为1×107/ml;100ul),模型组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。于造模开始后的第50天处死小鼠取材。(3)观察指标:①小鼠结肠组织结构;②血清中IL-6、TNF-a的浓度;炎症细胞免疫组化染色;③结肠组织中杯状细胞染色;④结肠组织中胶原纤维染色。⑤小鼠每天的精神状态与体重;⑥粪便形态;⑦便血情况;⑧结肠组织中Claudin-1、Occludin、IL-6基因相对表达量;VEGF-A、VEGFR-1、Occludin蛋白表达量。4、脐带间充质干细胞对IBD作用机制分析采用Western blot实验法检测结肠组织中自噬标志蛋白LC3A/B、紧密连接蛋白Occludin、血管内皮生长因子VEGF-A体VEGFR-1达;qPCR法分析紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin、炎症因子IL-6的表达;采用GFP标记UCMSC与免疫组化法观察UCMSC在体内的分布。[结果]1.UCMSC 鉴定人源与KM鼠源的UCMSC均呈纤维状,贴壁生长。KM鼠源UCMSC标志物CD 105、CD90表达率分别为99.9%、100%;而CD34的表达率为0.239%,人源UCMSC标志物CD73、CD90、CD105 表达率分别为 97.5%、98.2%、97.5%;CD34、HLA-DR、CD45+的表达率分别为0.861%、2.22%、0.695%。两种UCMSC均可被诱导分化为类脂肪细胞、骨样、软骨样细胞。2.模型创建与评价IBD急性模型:小鼠在饮用3%DSS溶液4天后,出现便血,5天后体重开始下降,便血加重,精神萎靡,嗜睡懒动,聚集。大体解剖:可见小鼠全结肠或部分结肠有充血水肿、溃疡。组织病理与染色示:肠上皮结构破坏、腺体紊乱、杯状细胞减少,肠壁全层有大量胶原纤维沉积。慢性IBD模型,小鼠表现为间断便血,体重维持在较低水平(为最初体重的85%左右),炎症细胞浸润肠壁各层,腺体样结构几乎消失,肠腔狭窄。3.UCMSC 疗效(1)UCMSC治疗急性IBD的疗效:观察期间内,腹腔注射UCMSC组、静脉注射UCMSC组、模型组的体重下降百分比分别为:11%、14%、17%。腹腔注射UCMSC组、静脉注射UCMSC组、模型组各组死亡率分别为:0%、8.3%、33%。IL-6在腹腔注射UCMSC组、静脉注射UCMSC组、模型组中的血清浓度分别为:27.17±1.48(pg/ml)、71.11 ±9.19(pg/ml)、104.90±9.78(pg/ml)(p<0.05)。TNFa在腹腔注射UCMSC组、静脉注射UCMSC组、模型组中的血清浓度分别为:119.50±12.33、153.67±1.50、174.92 ±7.72(pg/ml)(p<0.05)。qPCR 结果提示,腹腔注射UCMSC组的Claudin1、occludin较其他三组的表达增加(p<0.05)。正常对照组、腹腔注射治疗组、静脉注射治疗组、模型组的组织病理学评分分别为0.5±0.30;5.9±1.10;8.7±1.39;8.8± 1.33(p<0.05)。(2)人和KM鼠UCMSC治疗慢性IBD的疗效:人和KM鼠UCMSC组、模型组的死亡率分别为:0%、13.3%、60%。人和KM鼠UCMSC组的结肠组织中的CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞浸润较少,与正常对照组接近,而模型组则呈弥漫性浸润。人UCMSC治疗组与KM鼠UCMSC治疗组结肠组织中的杯状细胞分布更均匀,密度更大,颜色深染,胶原纤维渗出较少,模型组情况与之相反。LC3A/B在人、KM鼠UCMSC组中的蛋白表达量低于其他两组;VEGF-A、VEGFR-1与Occludin蛋白的表达在人UCMSC治疗组中表达升高。【结论]1、采用组织块培养法成功获得了 KM小鼠UCMSC细胞,UCMSC高表达CD90、CD105,低表达 CD34。人 UCMSC 高表达 CD73、CD90、CD105;低表达 CD34、CD45、HLA-DR。KM小鼠与人的UCMSC均具有向骨、软骨、脂质分化的潜能。2、采用连续或间断自由饮用3%DSS溶液成功建立了 IBD急、慢性模型。3、腹腔注射与静脉注射UCMSC治疗IBD急性模型,均显示有效,但腹腔注射疗效优于静脉注射法。4、人源UCMSC与KM鼠源的UCMSC均能降低小鼠IBD模型的死亡率,减轻肠炎,提示两种来源的UCMSC均有治疗作用。5、UCMSC促进肠紧密连接蛋白Occludin表达;下调结肠组织的自噬标志性蛋白LC3A/B的表达;上调受损部位VEGF-A与VEGFR-1的表达。6、UCMSC注入体内后,在肠、肝、脾、肺、肾器官组织中均有分布,其中脾脏中的分布最多。