蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）通过催化内质网二硫键的形成、断裂和重排以及伴侣蛋白的活性来介导蛋白质折叠,在维持细胞内稳态方面起着关键作用。除了在内质网中起到关键作用,PDI也存在于细胞外。已有证据表明PDI可以被分泌或运输到细胞表面,参与调控各种重要的生理过程。我们前期研究发现在慢性炎性疼痛时DRG神经元可以分泌PDI活性蛋白,通过胞外C617/C622/C635激活TRPV1通道,从而引起痛觉过敏。本论文是在前期研究的基础上进一步深入研究并证明PDI蛋白胞外激活TRPV1通道的致痛作用及治疗意义。第一部分DRG组织敲除PDI对小鼠基础热痛行为的影响目的:分析DRG组织敲除PDI对小鼠基础热痛反应行为的影响。方法:分别用热辐射、热板、甩尾法测定热痛阈值,来观察DRG局部敲除PDI对小鼠基础热痛值的影响。结果:我们使用热辐射、热板、甩尾三种热痛阈值检测法分别检测了SNS-Cre::PDIfl/fl小鼠与PDIfl/fl小鼠的生理性热痛阈值,发现在DRG局部敲除PDI的小鼠对热辐射以及不同温度的热板和热水刺激的反应阈值没有显著改变。结论:敲除DRG神经元中的PDI并不影响小鼠的基础热痛行为。第二部分TRPV1-KO小鼠DRG神经元表达TRPV1胞外半胱氨酸突变体对PDI所致疼痛的反应目的:通过在体实验证明PDI调节TRPV1通道的作用位点,及其对PDI所致疼痛的反应。方法:首先构建鼠源的TRPV1野生型腺相关病毒,以及三个胞外区的半胱氨酸突变位点C617A/C622A/C635A的TRPV1突变体病毒。用仅携带EGFP的腺相关病毒作为对照。将腺相关病毒注射到TRPV1-KO小鼠的L3和L4 DRG中。在病毒注射4-6周后,提出完整的小鼠的L3和L4 DRG,做免疫荧光染色来观察病毒表达情况,同时做全细胞膜片钳来观察TRPV1通道的功能表达情况。接下来,进行急性疼痛行为测试,观察TRPV1在DRG中的功能恢复是否会使小鼠对辣椒素和h PDI产生舔脚等痛觉行为反应。结果:在病毒注射4-6周后,提出完整的小鼠的L3和L4 DRG,免疫荧光染色结果可以观察到EGFP的荧光和TRPV1抗体染色的共标,验证了TRPV1和TRPV1突变体的表达;全细胞膜片钳结果表明,受TRPV1或TRPV1突变病毒影响的DRG神经元产生了辣椒素诱导的电流,在受对照病毒影响的DRG神经元中没有电流。在急性疼痛行为测试中,辣椒素（20μM,25μl,注射在后爪）在过表达TRPV1或TRPV1突变体的TRPV1-KO小鼠中都诱发了强烈的痛觉行为,与注射对照病毒的小鼠形成了鲜明的对比。当注射h PDI（100μM,25μl,注射在后爪）时,在过表达TRPV1突变体的TRPV1-KO小鼠中没有观察到明显超过注射对照病毒小鼠的痛觉行为,而在过表达野生型TRPV1的小鼠中产生了明显的痛觉行为。结论:1.突变胞外半胱氨酸残基并不影响TRPV1蛋白在DRG神经元上的功能性表达。2.PDI可以通过胞外半胱氨酸残基激活TRPV1蛋白诱导小鼠的疼痛反应。第三部分PDI抑制剂对小鼠慢性疼痛行为的治疗作用目的:探究PDI抑制剂对疼痛的缓解作用。方法:首先在野生型小鼠脚掌注射CFA制造慢性炎症性疼痛模型,或进行坐骨神经结扎手术诱导慢性神经病理性疼痛。在CFA注射或CCI手术后的第5天和第11天,向小鼠的后爪注射PDI抑制剂,同时进行对照注射,在注射后5小时进行行为学检测（包括Hargreaves热痛测试和Von Frey机械痛测试）。结果:与对照相比,在CFA和CCI模型中,RL90和PACMA-31在注射的两个时间点（第5天和第11天）均显著延迟对热刺激的撤退潜伏期。此外,注射两种PDI抑制剂当日热刺激的撤退潜伏期明显大于注射前日和注射后日。然而,RL90和PACMA-31均仅在第5天或第11天中的一个注射日缓解了CFA模型中的机械性痛觉过敏。接下来,用缺乏催化活性的PDI突变体PDIoooo作PDI的竞争性拮抗剂,实验结果表明,与对照相比,预先注射PDIoooo可显著减轻CFA和CCI模型第5天的热痛过敏。并且,PDI的天然抑制剂Rutin也可显著减轻CFA和CCI模型第5天的热痛过敏。结论:在CFA慢性炎症性疼痛模型和CCI慢性神经病理性疼痛模型中,抑制PDI蛋白可以缓解小鼠的慢性疼痛行为。