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目的:肾纤维化是各种慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)进展过程的重要途径,其中肾小管上皮细胞的上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和细胞外基质沉积,胶原增多有着极其重要的作用,此过程的确切机制至今仍未彻底阐明。蛋白质泛素化是一种关键的翻译后修饰过程,是泛素蛋白酶体系统(UPS)降解泛素相关蛋白质所必需的。目前公认的的泛素蛋白酶体系统包括激活酶(E1)、结合酶(E2)还有连接酶(E3)。首先,泛素激活的过程是由E1执行的;然后E2将泛素分子转给E3;最后,E3就会催化泛素分子及其靶蛋白分子之间的共价结合。目前发现的连接酶E3按照一定的结构划分为三个家族:RING(zinc-binding RING finger adaptor)家族,HECT(homologous with the carboxyl end of E6AP)家族和U-box(amodified cyclic motif)家族。E3酶有以下几种主要功能:1)识别特定底物2)转移泛素分子3)HECT家族的E3参与构成多泛素链所需的残基4)RING家族的E3可以将泛素分子从E2转至目标蛋白。Itch其作为E3泛素连接酶HECT家族中的重要的一分子,经过大量的研究与探索,发现了它参与了哺乳动物的生长发育过程,以及多种疾病的发生发展过程,并且是以免疫性疾病、炎症性疾病和肿瘤的发展中的作用及机制研究的最多,但Itch对于在肾间质纤维化的确切作用尚未阐述明了。本研究拟采用单侧输尿管梗阻模型小鼠和和TGF-β1刺激条件下的人肾小管上皮细胞(human renal tubular cell lines,HK-2),观察Itch的表达情况及其对Wnt通路和纤维化的影响,并在此基础上,应用Itch敲除小鼠,在HK-2细胞中过表达Itch基因,探究E3泛素连接酶Itch对肾小管上皮细胞转分化和纤维化的影响。方法:1.探究Itch在UUO小鼠肾组织中的表达和对TGF-β1诱导的HK-2转分化中的作用6-8周龄的C57BL/6背景的Itch+/+小鼠和Itch-/-小鼠分为假手术组(Sham)、UUO 3天组、UUO 7天组、UUO 14天组,Itch敲除对照组(Itch-/-),Itch敲除并UUO 14天组(UUO+Itch-/-),每组各5只。UUO模型切开游离输尿管并结扎,假手术组不结扎。造模成功后留取肾脏,RT-PCR检测Itch的m RNA的表达,HE、MASSON染色观察各组小鼠肾脏的病变情况,Western blot和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测E-cadherin、α-SMA、Collagen I和Fibronectin的蛋白表达情况。2.探究Itch在UUO小鼠肾脏Wnt通路的影响Western blot和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测假手术组(Sham)、UUO 14天组,Itch敲除对照组(Itch-/-),Itch敲除并UUO 14天组(UUO+Itch-/-)的β-catenin和DVL2的蛋白表达情况。3.观察Itch在TGF-β1刺激条件下的HK-2细胞的表达用不同浓度的TGF-β1刺激HK-2细胞48 h,分别为0、2.5、5、10、20 ng/ml,Western blot筛选出Itch变化程度最明显的浓度,再以此浓度刺激HK-2细胞持续不同的时间,分别为0、24、48、72 h,用RT-PCR和Western blot观察检测Itch的表达情况。从中选出的Itch变化最明显的时间点与TGF-β1浓度进行后续实验。4.探究过表达Itch对TGF-β1刺激下的HK-2细胞转分化的影响我们将HK-2细胞随机分为了正常组(N)、TGF-β1组(TGF-β1)、TGF-β1刺激加空载pcmv-MCS-3Flag质粒转染组(TGF-β1+C)、TGF-β1刺激加Itch过表达pcmv-MCS-3Flag-Itch质粒转染组(TGF-β1+OE),终止培养后,Western blot和细胞免疫荧光(Immunofluorescent,IF)检测Itch、E-cadherin、α-SMA和Fibronectin的蛋白表达,RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA和Fibronectin的m RNA表达。5.探究Wnt通路抑制剂IWR-1对TGF-β1刺激条件下HK-2转分化的影响我们将HK-2细胞随机分为了正常组(N)、TGF-β1组(TGF-β1)、TGF-β1和IWR-1共同刺激组(TGF-β1+IWR-1),终止培养后,Western blot和细胞免疫荧光检测E-cadherin、α-SMA和Fibronectin的蛋白表达。6.探究Itch对TGF-β1刺激下HK-2细胞Wnt/β-catenin通路的影响我们将HK-2细胞随机分为了正常组(N)、TGF-β1组(TGF-β1)、TGF-β1刺激加pcmv-MCS-3Flag(TGF-β1+C)、TGFβ1刺激加Itch过表达pcmv-MCS-3Flag-Itch质粒转染组(TGF-β1+OE),终止培养后,Western blot检测active-β-catenin和β-catenin的蛋白表达;部分正常组(N)和TGF-β1刺激组(TGF-β1)在终止培养前给与MG132刺激2 h后,用于Co IP检测DVL2与Itch,DVL2与Ubquitin之间的相互作用。结果:1.Itch在UUO小鼠肾脏组织中的表达和对TGF-β1诱导的HK-2细胞中的表达Western blot结果显示,与假手术组相比,UUO组Itch蛋白表达量在3天时已经开始降低,一直持续到14天,主要定位于细胞核与细胞浆。从HE染色与Masson染色的结果可以看出:Sham假手术对照组的肾脏中肾小球、肾小管的基本结构均为正常,肾间质部分没有明显的炎症及细胞外基质沉积等纤维化改变。UUO模型组肾脏结构有很明显的改变,肾小球萎缩,实质细胞逐渐被纤维细胞替代,部分肾小管的上皮细胞萎缩甚至脱落,官腔明显扩张,有些区域出现了整个小管结构的萎缩甚至纤维化,肾小管间质有各种炎细胞浸润,间质增生明显。RT-PCR显示Itch-/-鼠的Itch基因已经明显被敲除。Western blot和免疫组化结果显示,与假手术组相比,UUO组的E-cadherin水平降低、α-SMA、Fibronectin和collagen I的表达水平上升,Itch敲除后的UUO组E-cadherin水平降低更为明显、α-SMA、Fibronectin和collagen I的表达水平上升的也更为明显,但是单纯敲除Itch未进行UUO手术组这些指标并无明显变化。2.探究Itch在UUO小鼠肾脏Wnt通路的影响Western blot结果显示,与假手术组相比,UUO组的β-catenin和DVL2的表达水平上升,Itch敲除后的β-catenin和DVL2的表达水平上升的也更为明显,但是单纯敲除Itch未进行UUO手术组这些指标并无明显变化,与免疫组织化学结果一致。3.Itch在不同浓度TGF-β1刺激不同时间的HK-2细胞中的表达情况Western blot检测结果显示Itch的蛋白表达在TGF-β1不同浓度刺激后表达降低,其中10 ng/ml时降低最为明显。并以此浓度TGF-β1刺激不同时间点后Itch蛋白的表达同样降低,在48 h达到峰值,与RT-PCR结果一致。4.Itch对TGF-β1刺激下的HK-2细胞转分化的影响Western blot和细胞免疫荧光结果显示,与N组对比,TGF-β1刺激后Itch蛋白的表达量降低,E-cadherin的表达降低,α-SMA的表达升高,Fibronectin的表达也升高,但在TGF-β1基础上过表达Itch后E-cadherin的表达升高,α-SMA的表达降低,Fibronectin的表达也降低。5.Wnt通路抑制剂IWR-1对TGF-β1刺激条件下HK-2转分化的影响Western blot细胞免疫荧光结果显示,与N组对比,TGF-β1刺激后E-cadherin蛋白的表达降低,α-SMA、Fibronectin的表达升高,但用IWR-1抑制Wnt/β-catenin通路后E-cadherin的表达升高,α-SMA的表达降低,Fibronectin的表达也降低。6.Itch对TGF-β1刺激下的HK-2细胞Wnt/β-catenin通路的影响Western blot结果显示,与N组对比,TGF-β1刺激后Wnt通路的核心蛋白active-β-catenin、β-catenin均升高,但过表达Itch后逆转了上述指标的改变(图12)。并且Co IP结果表明Itch与DVL2有相互作用,用蛋白酶体抑制剂MG132可以减少DVL2蛋白的泛素化降解。结论:1.Itch在UUO小鼠肾皮质和体外培养的接受TGF-β1刺激的HK-2细胞中Itch的表达降低。2.Itch通过促进DVL蛋白的泛素化降解抑制Wnt通路,从而抑制肾小管上皮的转分化与肾脏纤维化的进程。3.抑制Wnt通路可以抑制肾小管上皮细胞的转分化。