背景：　　RNA剪接和加工是真核细胞基因表达的一个重要生物过程，同时RNA剪接异常所产生的基因也是引起各类疾病，尤其是癌症的天然来源。随着肿瘤中异常可变剪接基因数量的日益增多，RNA剪接也成为影响肿瘤发生和发展的一个关键因素，因此研究RNA剪接功能对于探索肿瘤病因以及癌症的预防和治疗具有重要意义。NRF2(NF-E2 p45-related factor2)/ARE(antioxidant response element)信号通路是机体内重要的抗氧化防御系统，能够通过调控一系列二相解毒酶以及抗氧化酶基因的表达发挥细胞防御功能，在癌症的化学预防中发挥重要作用。但在许多肿瘤细胞中，由于KEAP1突变或NRF2突变导致NRF2在肿瘤细胞内呈异常活跃状态，并通过促进肿瘤细胞恶性增殖以及耐药性，对肿瘤细胞起到保护作用，因此NRF2基因又能作为一个癌基因而存在。但NRF2基因在肿瘤细胞内的高表达是否与RNA剪接相关联，以及NRF2突变能否造成RNA剪接异常以及影响重要基因的剪接及功能目前尚未见报道。　　目的：　　基于以上科学问题，本课题拟通过建立NRF2敲除以及NRF2过表达的细胞模型，并通过RNA高通量测序分析肿瘤细胞中NRF2的表达对RNA剪接的影响，并探讨相应的分子机制。　　方法：　　本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建NRF2敲除细胞株，同时使用慢病毒感染方法构建NRF2过表达细胞株。使用RNA高通量测序技术及生物信息学分析NRF2对RNA剪接的影响。为探讨NRF2调控RNA剪接的机制，利用构建好的细胞株以及使用RNA干扰方法，并使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、荧光素酶报告基因系统以及免疫印记技术探讨NRF2对剪接体组装蛋白SMN转录水平及蛋白水平的影响。利用免疫共沉淀、GST pulldown、免疫荧光及串联亲和纯化多种技术探讨NRF2与SMN的相互作用及共定位关系，并通过构建NRF2及SMN不同片段的突变或缺失质粒，确定NRF2与SMN相互作用的位点。最后通过基因补偿手段进一步确认NRF2对RNA剪接的调控作用。　　结果：　　(1)成功构建了NRF2敲除细胞株及NRF2过表达细胞株，并利用实验室已有的NRF2降表达细胞株进行RNA高通量测序表明，NRF2敲除、NRF2降表达及NRF2过表达均能够造成肿瘤细胞中异常剪接事件的发生，包括mRNA剪接异常以及可变剪接异常。　　(2)NRF2能够调节SMN以及SMN复合体的蛋白水平:通过荧光素酶报告基因检测系统发现NRF2能够通过结合SMN启动子上的ARE序列，上调SMN基因的转录水平。反之，NRF2敲除或降表达则下调SMN，同时能够下调SMN复合体组分蛋白GEMIN2蛋白的表达，以及卡哈尔体标志蛋白COILIN的蛋白表达。　　(3)NRF2与SMN复合体相互作用:免疫共沉淀研究表明NRF2与SMN蛋白能够在A549细胞内相结合。免疫荧光研究表明NRF2与SMN能够在A549及HeLa细胞内发生共定位，并且在tBHQ诱导的应激状态下NRF2仍能够与SMN复合体在HeLa细胞内发生共定位。使用免疫荧光三色共染技术证明NRF2能够与SMN复合体相结合并且共定位在卡哈尔体内。通过免疫共沉淀及GST pulldown手段证明NRF2与SMN具有直接的相互作用，SMN的三个片段(45-90，227-248，268-294)与NRF2相结合，并且SMN(268-294)是与NRF2相结合的关键片段。最后串联亲和纯化技术进一步证实了NRF2能够与SMN、GEMIN2蛋白形成复合体。　　(4)在NRF2敲除细胞株中分别补偿NRF2或SMN基因，通过RNA高通量测序分析发现，NRF2与SMN基因补偿均能够明显纠正NRF2敲除造成的剪接异常事件。补偿NRF2能够纠正1008个异常剪接基因，补偿SMN基因能够纠正1106个异常剪接基因，并且NRF2与SMN共同纠正的基因为916个，由NRF2单独纠正的基因为92个。　　结论：　　本研究发现NRF2能够调节RNA的剪接事件，包括mRNA剪接事件以及可变剪接事件。此外通过对NRF2调控RNA剪接的机制进行探讨发现，NRF2可能通过两种途径调控RNA剪接:(1)NRF2促进剪接体组装蛋白SMN的转录水平以及SMN复合体的蛋白水平影响SMN的剪接功能;(2)NRF2能够与SMN复合体直接结合并共定位在剪接体加工场所-卡哈尔体内参与RNA剪接。