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胆固醇的侧链氧化产物羟基胆固醇,其侧链含有羟基基团,在脂质代谢中起着多重作用。其中含量最丰富研究最多的一类为27HC。27HC几乎全部来自于外周,在循环过程中透过血脑屏障流入脑内,由于胆固醇不能直接通过血脑屏障,27HC在维持脑内和脑外的胆固醇平衡中起着重要作用。相关研究表明,给予实验大鼠高胆固醇饮食干预后,循环血清中27HC水平升高,从而使进入脑内27HC增多,最终导致学习、记忆能力障碍,这说明27HC能够导致神经行为损伤。而AD患者脑内27HC水平明显升高,这种升高导致了脑脊液中可溶性淀粉样前体蛋白水平的增加,最终导致神经退行性病变的发生。综上所述,27HC在神经损伤及神经退行性疾病的发生发展过程起着重要的作用。随着生物体的衰老,机体平衡逐渐被打破,导致生物体丧失正常的生理功能,给个体健康及社会都带来了较大的负担。细胞衰老是生物体衰老的基础,细胞衰老最终导致生物体的衰老,而引起细胞衰老发生的机制主要包括端粒缩短,DNA损伤累积,异常癌基因激活,代谢改变以及高水平的ROS产生。研究发现27HC能够使脑内ROS水平增加引起神经细胞损伤进而导致神经毒性。信号转导和转录激活因子3（STAT3）在调节细胞功能中发挥多种作用。STAT3是细胞衰老和生长停滞的关键调节分子。最近的研究报道,STAT3在IL-6/gp130诱导肺成纤维细胞的衰老中起到至关重要的作用。另外,IL-22通过STAT3依赖性机制诱导活化的HSC细胞衰老。SIRT1是哺乳动物中重要的NAD+依赖性去乙酰化酶,参与许多重要的生理和病理过程,如细胞衰老和肿瘤发生。研究表明SIRT1通过去乙酰化STAT3的Lys-685位点抑制STAT3在肝细胞内对糖异生的抑制作用,以及抑制炎性细胞因子IL-12对STAT3的转录激活作用等。SIRT1去乙酰化STAT3也能抑制STAT3的磷酸化作用,最终调控STAT3的转录活性。基于上述研究背景,我们假设27HC可以通过ROS及SIRT1对STAT3乙酰化和磷酸化的调控从而发挥其促进细胞衰老的作用。本研究为探讨27HC在神经退行性疾病发病机制中的作用提供新的科学依据。目的:本研究采用BV2小胶质细胞、PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞为体外模型,探讨27HC能否诱导神经细胞衰老及其具体机制研究。采用斑马鱼模式动物为体内模型,进一步观察27HC在体内对斑马鱼幼鱼神经行为及衰老的影响。方法:采用SA-β-Gal染色方法检测27HC对体内及体外衰老的影响;采用ROS检测试剂盒检测27HC对体内体外活性氧生成的影响;采用Western Blot检测STAT3的磷酸化和乙酰化水平,以及SIRT1和DNMT1的表达;采用ELISA检测IL-6的分泌水平;采用qRT-PCR检测IL-6以及SIRT1的表达;采用Noldus DanioVision斑马鱼行为轨迹跟踪系统,对27HC暴露后幼鱼的自发运动实时跟踪记录;采用Ethovision XT11.5软件将运动轨迹可视化,并导出运动参数用于后期统计分析。结果:一、磷酸化STAT3在27HC诱导细胞衰老中的作用（一）27HC对神经细胞衰老及细胞内活性氧的影响用10μM 27HC分别处理BV2和PC12细胞12 h及24 h,两种细胞的衰老阳性细胞数明显增多,且ROS水平明显高于对照组;而E2并不能够诱导两种细胞中衰老发生及ROS水平增加;用2 mM NAC预处理细胞2 h后,再加入10μM27HC分别处理BV2和PC12细胞12 h及24 h后,衰老阳性细胞数及ROS水平与27HC单独处理组相比明显受到抑制。（二）27HC对磷酸化STAT3的调控作用用10μM 27HC处理BV2细胞0、2、4、8、12和24 h后,BV2细胞中IL-6的表达和分泌增加,p-STAT3Tyr705水平也明显升高;而E2并没有上调细胞内IL-6水平及p-STAT3Tyr705的表达;加入NAC清除细胞内的ROS后,27HC对IL-6和p-STAT3Tyr705的上调作用被削弱。在PC12细胞中,27HC同样上调了p-STAT3Tyr705的表达。加入NAC后,27HC对p-STAT3Tyr705的上调作用被减弱。（三）磷酸化STAT3在27HC诱导神经细胞衰老中的作用用10μM Stattic或0.2μg/ml IL-6中和抗体预处理BV2和PC12细胞30 min后,再加入10μM 27HC分别处理细胞12 h、24 h后,与27HC单独处理组相比,Stattic及IL-6中和抗体抑制STAT3激活和IL-6表达后,衰老阳性细胞数明显减少,27HC促进衰老的作用被削弱。二、乙酰化STAT3在27HC诱导细胞衰老中的作用（一）27HC对乙酰化STAT3及SIRT1的调控作用用10μM 27HC或10 nM E2分别处理两种细胞12 h、24 h后,与E2对SIRT1的保护及对Ac-STAT3的抑制作用不同,27HC明显抑制了SIRT1的表达,并且上调Ac-STAT3 Lys685的水平。（二）SIRT1在27HC诱导STAT3乙酰化中的作用用si-NC或si-SIRT1转染BV2或PC12细胞后,Ac-STAT3 Lys685表达上升;用20μM REV处理细胞2 h后,再加入10μM 27HC分别处理两种细胞12 h、24h后,SIRT1的抑制作用以及对Ac-STAT3的上调作用均被削弱。（三）27HC通过ROS介导SIRT1的甲基化沉默用10μM 27HC、SAM处理两种细胞后,上调了细胞中DNA甲基转移酶DNMT1的表达,抑制SIRT1的表达;同时,27HC联合甲基转移酶抑制剂AZA及活性氧清除剂NAC处理后,与单独的27HC处理组相比,27HC对SIRT1的抑制作用及对DNMT1的上调作用在加入AZA或NAC联合处理后被明显削弱。（四）乙酰化STAT3在27HC诱导神经细胞衰老中的作用用10μM C646预处理BV2和PC12细胞1 h后,再加入10μM 27HC分别处理细胞12 h、24 h后,与27HC单独处理组相比,C646明显抑制了STAT3乙酰化水平,且衰老阳性细胞数明显减少,27HC促进衰老的作用被削弱。三、SIRT1在27HC诱导STAT3磷酸化中的作用用si-NC或si-SIRT1转染BV2或PC12细胞12 h后,再加入0或20μM REV处理细胞24 h,转染si-SIRT1敲低SIRT1的表达后,IL-6及p-STAT3Tyr705表达均上升;REV单独作用并没有抑制由于SIRT1敲低而引起的IL-6/STAT3激活。用20μM REV处理细胞2 h后,再加入10μM 27HC分别处理两种细胞12 h、24 h后,27HC对IL-6及p-STAT3Tyr705的上调作用在加入REV后被明显削弱。四、SIRT1在27HC诱导神经细胞衰老中的作用用20μM REV处理细胞2 h后,再加入10μM 27HC分别处理BV2和PC12细胞12 h、24 h后,与27HC单独处理组相比,联合REV处理组的衰老阳性细胞数明显减少,27HC促进衰老的作用被削弱。五、27HC暴露对斑马鱼幼鱼神经行为及衰老的影响将斑马鱼胚胎分别暴露于0、10、20、30、40μM 27HC受试液中,孵化至4 dpf,斑马鱼胚胎死亡率呈剂量依赖性升高。将斑马鱼幼鱼分别暴露于20μmol·L-1 27HC、10 nmol·L-1 E2、20μmol·L-1NAC、1μmol·L-1 REV受试液中,给药时间为受精后36 h（36 hpf）受精后4 d（4dpf）。27HC处理后斑马鱼幼鱼体内的ROS水平明显升高,同时加入ROS清除剂NAC后,27HC升高的ROS水平被明显抑制;27HC暴露后,斑马鱼幼鱼的神经管部位神经衰老染色蓝色明显加深且蓝色颗粒较多,而给予活性氧清除剂NAC或REV处理后蓝色变浅且颗粒减少,减缓了衰老的发生此外,与正常对照组和E2相比,27HC暴露组幼鱼70%不再沿96孔板内壁进行常规转弯,自发运动轨迹增多、紊乱,并伴有刻板式转向、触壁反射活动减少和小范围内转圈现象。同时,联合NAC或REV处理后,幼鱼的这种不规则运动有所缓解。此外,幼鱼黑暗状态下3 min的自发运动参数分析发现,与正常对照组和E2相比,27HC暴露后,幼鱼的运动距离变短,平均运动速度减慢。同时,联合NAC或REV处理后,27HC对幼鱼自发运动距离和平均运动速度的抑制作用被削弱。27HC暴露后,与正常对照组和E2相比,抑制了幼鱼体内SIRT1的表达;同时,联合NAC或REV处理后27HC对SIRT1的抑制作用被削弱。结论:本课题使用BV2及PC12细胞为体外模型,斑马鱼作为体内模型,研究发现27HC通过诱导细胞内ROS产生上调SIRT1的甲基化水平,从而增强了STAT3的磷酸化及乙酰化水平,进而促进细胞衰老的发生及斑马鱼神经行为的改变。