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青蒿素是从中国传统药用植物青蒿(Artemisia annua L.)中分离得到的一种倍半萜内酯类化合物,是世界卫生组织(WHO)推荐的目前最有效的疟疾治疗药物。由于青蒿中青蒿素的含量较低(约占干重的0.01%-0.8%),导致青蒿素类抗疟药物的成本较高,而疟疾的流行区域又主要分布在发展中国家,因此降低药物价格就显得尤为重要。青蒿是目前青蒿素的唯一来源,故提高青蒿中青蒿素的含量是降低青蒿素类药物成本的关键所在。近年来青蒿素生物合成途径及其调控的研究已成为本领域研究的热点,尽管已取得一些突破性研究进展,但青蒿素含量的提高仍然有限。为此,本论文围绕青蒿素生物合成的调控开展了以下两方面的工作: 1.过表达WRKY转录因子对青蒿素生物合成的调控 WRKY转录因子是近年来在植物中发现的特有新型转录调控因子,因其N端含有由WRKYGQK组成的高度保守的氨基酸序列而得名。受WRKY转录因子调控的基因启动子中,均含有保守的W-box序列(TTGAC)。紫穗槐二烯合酶(armorpha-4,11-diene synthase,ADS)是参与青蒿素生物合成分支途径中的第一个关键酶,主要催化异戊二烯生物合成途径中共同的前体法呢基焦磷酸环化形成紫穗槐二烯,而ADS的启动子序列中含有WRKY转录因子的结合元件W-box。AaWRKY是我们实验室之前从青蒿分泌腺毛cDNA文库中的EST序列分离得到的WRKY家族的一个转录因子,经瞬时转化青蒿的研究表明,它对青蒿素生物合成的关键基因ADS及其它青蒿素生物合成相关基因(HMGR,FPS, DBR2,CYP)的表达起上调作用。为了进一步研究AaWRKY转录因子对青蒿素生物合成的调控,我们构建了AaWRKY过表达植物表达载体,通过根癌农杆菌介导转化青蒿后共得到5株转基因植物,转基因植物中的青蒿素含量比对照均有不同程度地提高,其中青蒿素含量增幅最高的株系比对照增加33%,同时转基因植物中青蒿素生物合成相关基因的表达均有不同程度的上调。上述结果表明,AaWRKY的过表达可能是通过上调青蒿素生物合成相关基因的表达而促进青蒿素的生物合成。 2.油菜素内酯对青蒿素生物合成的调控 油菜素内酯是一种植物生长调节剂,它对启动子序列中含有E-box(CANNTG)元件的基因表达具有明显的调控作用。青蒿素生物合成的关键基因ADS、DBR2和CYP71AV1启动子中均含有此序列元件。本论文研究了油菜素内酯处理对青蒿中青蒿素生物合成的影响。结果表明:80μM的油菜素内酯是处理青蒿的最适浓度;80μM油菜素内酯处理4d后青蒿素含量比对照增加1倍多,在该处理条件下青蒿素生物合成的关键基因ADS, CYP71AV1,DBR2的表达均被上调。本研究的结果表明,油菜素内酯通过促进青蒿素生物合成关键基因的表达而促进青蒿素的生物合成。这一研究结果对生产上提高青蒿素含量具有一定参考价值。