研究背景鼻咽癌是发生于鼻咽上皮的恶性肿瘤,好发于中国华南地区和亚洲东南部。鼻咽癌发病隐匿,恶性程度较高,早期即可出现颈部淋巴结转移,其发生是一个多阶段、多途径、多机制、多遗传变异积累的复杂过程,目前认为主要与EB病毒的感染、遗传易感性及环境因素有关。虽然放疗能有效地控制早期鼻咽癌,但是晚期患者的平均5年生存率仍低于30-40%。更严重的是,由于早期没有显著的症状,临床上超过60%的鼻咽癌患者容易被忽视而发展为晚期阶段。因此,有必要寻找新的有效治疗鼻咽癌的治疗靶点和干预措施。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的非编码RNAs,主要通过靶向特定基因的3’UTR而抑制基因的转录后翻译。它们作为人类生理机能和疾病发生的重要调节因子,已成为有重要潜能的治疗靶标。许多miRNAs的异常表达与人类疾病包括癌症的发生有关。目前研究表明,一些miRNAs的异常表达与许多肿瘤的发生有关（包括鼻咽癌）。例如miR-184、miR-34b、miR-92a、miR-93、miR-27a、miR-101、miR-497和miR-663等的异常表达与细胞增殖、细胞周期和肿瘤发生等多种细胞反应有关。另外,有研究报道miR-148a、miR-155、miR-377、miR-92a、miR-200c、miR-23a、miR-130b、miR-30a、miR-149 和 miR-93 等 miRNAs参与调控多种肿瘤的转移和EMT,其中只有三个miRNAs被报道与鼻咽癌的EMT 有关。查阅最新文献显示,miR-22、miR-135a、miR-29c、miR-124、miR-142、miR-499、miR-133、miR-103/107 家族、miR-24 和 miR-200a 等 miRNAs 的异常表达与肿瘤的“干性”和耐药性有关,其中只有miR-200a这一个miRNA被报道可以促进鼻咽癌细胞的“干性”。因此,不断深入探究miRNAs在疾病及肿瘤发生发展中的作用及机制,对于找寻疾病治疗的新靶点至关重要。EB病毒（EBV）感染与鼻咽癌发生密切相关,在大部分角化鳞状上皮细胞癌和几乎所有未分化的鳞状细胞癌都有EB病毒的存在。EB病毒作为鼻咽癌的主要发病因素,它可编码25种miRNA前体,其中包括3种BHRF1 miRNAs前体和22种BART miRNAs前体。许多研究逐渐表明,该病毒能积极释放其编码的BART miRNAs从而有效的调节病毒和宿主细胞的功能。许多EB病毒编码的BART miRNAs被报道与病毒的潜伏感染、免疫逃逸、细胞存活、细胞增殖和凋亡有关。例如,在鼻咽癌中EBV-miR-BARTl可影响多个代谢相关基因的表达;EBV-miR-BART2通过抑制病毒DNA聚合酶BALF5的表达而减少EBV的裂解复制;EBV-miR-BART5-5p和miR-BART19-5p可以抑制病毒编码的LMP1蛋白的表达,而EBV-miR-BART22可以减少病毒编码的LMP2A蛋白的表达;EBV-miR-BART15-3p通过抑制凋亡抑制因子BRUCE的表达而促进细胞凋亡;在鼻咽癌中miR-BART3*能靶向肿瘤抑制因子DICE1进而促进细胞的生长和转化。这些研究和发现为鼻咽癌的治疗方案开辟了新的前景,鼓励更多的研究来开发新的以miRNA为靶标的治疗方法。EBV-miR-BART7-3p作为BART-miRNA家族的一员,是鼻咽癌的潜在调控因子之一。已经有两篇文献报道EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌组织和病人血清样本中高表达,并且在体外与鼻咽癌细胞的增殖相关,但是其在鼻咽癌发生发展中潜在的分子机制仍不清楚。在本研究中,我们首先利用in-house高通量miRNAs表达谱芯片检测并筛查出鼻咽癌组织（NPC）和慢性鼻咽炎组织（NP）中差异表达倍数较高的EBV miRANs;同时,通过荧光定量PCR（qPCR）实验发现高表达的EBV-miR-BART7-3p与鼻咽癌患者的T分期（肿瘤大小）、N分期（局域淋巴结转移）和临床分期呈正相关,这揭示EBV-miR-BART7-3p可能在鼻咽癌的发生发展中扮演了某种重要角色。于是我们构建慢病毒载体,感染鼻咽癌细胞,建立稳定过表达EBV-miR-BART7-3p的鼻咽癌细胞株,检测其对鼻咽癌细胞增殖、转移、侵袭和干性等生物学行为的影响;更有意义的是,我们通过查阅文献和生物信息学预测,进一步寻找并确认EBV-miR-BART7-3p调控的宿主靶基因及相关信号通路,探讨其发挥生物学作用的分子机制。基于以上研究,我们还针对性地开展以EBV-miR-BART7-3p为靶标的治疗实验,试图为鼻咽癌治疗的新策略提供理论和实验依据。研究目的1、明确EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌中的生物学功能,为进一步探讨EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌中的作用机制及靶向治疗提供依据。2、明确EBV-miR-BART7-3p靶向调控的宿主基因。3、探究EBV-miR-BART7-3p通过靶向宿主基因及下游信号通路而发挥生物学作用的分子机制。4、以EBV-miR-BART7-3p作为靶标进行体内外治疗实验,探究其能否作为鼻咽癌患者治疗的新靶标。方法与结果第一章 EBV-miR-BART7-3p靶向抑制PTEN的表达进而促进鼻咽癌细胞的转移及EMT方法1、应用miRNAs表达谱芯片技术,检测出差异表达倍数最高的EBV miRNA,qPCR验证这一结果。2、构建慢病毒载体,感染鼻咽癌细胞,建立稳定过表达EBV-miR-BART7-3p的鼻咽癌细胞株（CNE1-BART7-3p 和 5-8F-BART7-3p）。3、通过一系列体外（transwell、boyden小室实验）和体内实验（裸鼠肝包膜注射成瘤实验）检测EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞侵袭及转移的影响。通过形态学观察及western blot、免疫组化（IHC）实验检测EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞EMT的影响。4、通过文献检索及生物信息学预测初步确定EBV-miR-BART7-3p调控的宿主靶基因,利用荧光素梅报告基因实验及western blot、IHC实验进一步确定EBV-miR-BART7-3p调控的宿主靶基因,同时应用qPCR检测EBV-miR-BART7-3p与靶基因在鼻咽癌组织中表达量之间的相关性。5、应用 western blot、IHC、免疫荧光（IFC）确定 EBV-miR-BART7-3p 调控靶基因的下游信号通路,同时利用siRNA靶向沉默鼻咽癌细胞中靶基因的表达及在稳定表达EBV-miR-BART7-3p鼻咽癌细胞中转染靶基因（不含3’UTR）表达载体后检测相关表型及基因功能的变化。6、在EBV阳性的鼻咽癌细胞中,沉默内源性EBV-miR-BART7-3p表达,并进行表型和功能检测。结果1、通过对广东省中山市16例鼻咽癌组织和20例非癌鼻咽癌组织进行miRNAs表达谱芯片分析,发现EBV-miR-BART7-3p差异表达倍数最高。同时在新收集的42例有TNM分期的鼻咽癌标本中通过qPCR验证芯片的结果,发现EBV-miR-BART7-3p不仅高度表达,还与鼻咽癌患者的N分期和临床分期呈正相关。2、为了进一步探究EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌发生发展的作用,我们用订制的携带EBV-miR-BART7-3p的慢病毒载体（上海吉玛公司）感染鼻咽癌细胞CNE1和5-8F,建立稳定过表达EBV-miR-BART7-3p的鼻咽癌细胞株（CNE1-BART7-3p和5-8F-BART7-3p）,同时建立了相应的对照细胞株（CNE1-NC和5-8F-NC）。以鼻咽癌组织为阳性对照,qPCR检测证实CNEl-BART7-3p和5-8F-BART7-3p中EBV-miR-BART7-3p的表达水平与鼻咽癌组织中相当。3、Transwell和boyden小室实验显示,与对照组相比,CNE1-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞穿膜细胞数更多,说明EBV-miR-BART7-3p能够促进鼻咽癌细胞的转移和侵袭。沉默EBV-miR-BART7-3p的表达则转移和侵袭能力下降。同时,裸鼠肝包膜注射成瘤实验也显示,与对照组相比,实验组中肝内和淋巴结转移的数量比对照组更多。4、Western blot结果显示,EMT相关上皮标志物E-cadherin在实验组表达下调,而间充质标志物Vimentin和Fibronectin表达上调;同时观察到实验组细胞发生了上皮间充质转化,即细胞间隙变大,形态由椭圆形变为长梭形。对体内实验中固定的肿瘤组织进行免疫组化实验检测EMT相关标志物的表达,结果显示 E-cadherin 表达下调,而 Vimentin、Fibronectin 和 FOXM1 表达上调。5、文献调研和生物信息学预测结果显示,EBV-miR-BART7-3p与肿瘤抑制基因PTEN的3’ UTR能很好的匹配。荧光素酶报告基因实验结果显示PTEN wild-type 3’ UTR与EBV-miR-BART7-3p mimics共转染后,荧光素酶活性降低,差异有统计学意义;Western blot及IHC结果显示PTEN在实验组表达下调;qPCR实验显示与NP组织标本相比,PTEN在NPC组织标本中表达显著下调,并且与EBV-miR-BART7-3p 的表达呈负相关（r=-0.3823,P=0.0125）。6、Western blot显示EBV-miR-BART7-3p可以通过靶向PTEN的表达而激活PI3K/Akt/GSK-3 β 信号通路,同时 IHC、IFC 结果显示 EBV-miR-BART7-3p 可以促进转录因子Snail和β-catenin的核聚集从而促进鼻咽癌细胞的转移和侵袭。用siRNA靶向沉默鼻咽癌细胞中PTEN的表达后,transwell和boyden小室实验结果显示鼻咽癌细胞的转移及侵袭能力增强,western blot实验结果显示信号通路也发生相应的变化。稳定表达EBV-miR-BART7-3p鼻咽癌细胞中转染PTEN（不含3’ UTR）表达载体后鼻咽癌细胞的转移及侵袭能力减低,鼻咽癌细胞的EMT表型改变部分逆转,并下调PI3K/Akt/GSK-3 β信号通路。7、沉默 HONE1-EBV 细胞中 EBV-miR-BART7-3p 表达后,transwell 和 boyden 小室实验结果显示鼻咽癌细胞的转移及侵袭能力下降,PI3K/Akt/GSK-3 β信号通路下调。在HONE1-EBV细胞中转染PTEN（不含3’UTR）表达载体后,细胞的转移及侵袭能力减低。第二章EBV-miR-BART7-3p通过促进转录因子c-Myc和c-Jun的表达进而促进鼻咽癌细胞的生长及增殖方法1、通过MTT、平板克隆形成实验、细胞周期实验及小鼠皮下成瘤实验检测EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞生长及增殖能力的影响。2、通过western blot、qPCR实验进一步确认EBV-miR-BART7-3p通过调控靶基因而影响下游信号通路的分子机制。同时采用siRNA靶向沉默PTEN的表达,检测鼻咽癌细胞功能及机制的变化。结果1、MTT结果显示,与对照组细胞相比,CNE1-BART7-3p和5-8F-BART7-3p生长速度更快,稳定细胞株中转染inhibitor之后,则生长速度下降;平板克隆形成实验结果显示实验组克隆形成数量更多,转染inhibitor之后,则克隆形成数量减少;细胞周期实验结果显示实验组处于G1期的细胞数量减少,而处于S期及G2期的细胞数量增多,转染inhibitor之后则结果相反。2、小鼠皮下成瘤实验结果显示,注射5-8F-BART7-3p细胞的裸鼠要比注射对照组细胞的裸鼠的肿瘤生长更快,体积更大。IHC结果显示,实验组肿瘤的细胞增殖指标Ki67和PCNA表达增强。3、Western blot 结果显示,EBV-miR-BART7-3p 通过上调 PTEN/PI3K/Akt 信号通路而促进转录因子c-Myc和c-Jun的表达;qPCR结果显示实验组中细胞周期相关蛋白表达上调,细胞周期抑制因子表达下调;在稳转细胞株中抑制EBV-miR-BART7-3p表达后则结果相反。4、用siRNA靶向沉默鼻咽癌细胞中PTEN的表达后,与对照组相比:MTT显示细胞生长速度更快;平板克隆形成实验显示克隆形成数量更多;细胞周期结果显示,处于G1期的细胞数量减少,而处于S期及G2期的细胞数量增多;Western blot结果也显示,PTEN/PI3K/Akt/c-Myc和c-Jun信号通路表达上调。第三章EBV-miR-BART7-3p靶向抑制Smad7的表达进而促进鼻咽癌细胞的“干性”及降低化疗药物敏感性方法1、利用病毒感染的方法构建新的稳定过表达EBV-miR-BART7-3p的鼻咽癌细胞株（CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p）,用NPC组织做阳性对照,qPCR实验检测转染效率。2、通过一系列体外（肿瘤球的培养、侧群细胞的分选、western blot、qPCR）和体内实验（裸鼠皮下成瘤率实验）检测EBV-miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞“干性”的影响。3、利用药物敏感性实验检测CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p及其对照组细胞对临床一线化疗药物（顺铂、氟尿嘧啶、紫杉醇）的敏感性,同时在EBV 阳性的鼻咽癌细胞中（HONE1-EBV）沉默EBV-miR-BART7-3p的表达后,考察其对以上三个化疗药物的敏感性。应用腹腔注射化疗药物的方法治疗皮下成瘤的裸鼠,考察其治疗效果。4、芯片分析、调研文献及生物信息学预测确定EBV-miR-BART7-3p是否调控其他宿主靶基因,再利用荧光素酶报告基因实验及western blot、qPCR实验进一步确定靶基因。5、应用 western blot、IHC、IFC 进一步确定 EBV-miR-BART7-3p 调控的相关信号通路,同时在EBV 阳性细胞中进一步验证。采用siRNA靶向沉默靶基因的表达及稳定表达EBV-miR-BART7-3p鼻咽癌细胞中转染靶基因（不含3’UTR）表达载体,分析相关机制、表型及功能的变化。结果1、利用病毒感染的方法建立一个新的稳转细胞株（CNE2-BART7-3p）,以NPC组织为阳性对照,qPCR实验验证CNE2-BART7-3p中EBV-miR-BART7-3p的表达量与NPC组织中相当。2、与对照组细胞相比,CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞株中:肿瘤球培养实验结果显示肿瘤球的成球个数及大小均增加;侧群实验显示侧群细胞的数量增多（HONE1-EBV及HK1-EBV细胞中转染inhibitor之后,则侧群细胞的数量减少）;Western blot 及 qPCR 表明干性相关标志物（ABCG2、Oct4、Nanog、Sox-2）表达上调。裸鼠皮下成瘤率实验显示,将不同数量级的CNE2-NC和CNE2-BART7-3p细胞注射进裸鼠皮下,CNE2-BART7-3p细胞组的肿瘤形成率更高,肿瘤体积更大。3、药物敏感性细胞实验显示:与对照组相比,CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞株的死亡细胞数量更少,细胞生长更快;在HONE1-EBV细胞中沉默EBV-miR-BART7-3p的表达后,则死亡细胞数量更多,细胞生长更慢。体内实验显示,裸鼠腹腔注射顺铂后,与对照组相比,CNE2-BART7-3p细胞组的肿瘤生长仍更迅速,体积更大。4、生物信息学及荧光素酶报告实验确定EBV-miR-BART7-3p调控的的另一宿主靶基因Smad7;Western blot和qPCR结果显示,EBV-miR-BART7-3p过表达细胞中Smad7的表达下调;qPCR验证发现,与NP组织相比,NPC组织标本中的Smad7表达下调,并且与EBV-miR-BART7-3p的表达呈负相关（r=-0.7229,p<0.001）。5、Western blot显示EBV-miR-BART7-3p可以通过抑制Smad7的表达进而激活TGF-β信号通路;IFC结果证实EBV-miR-BART7-3p可以促进p-Smad2和p-smad3的入核而促进鼻咽癌细胞的干性。6、用siRNA靶向沉默Smad7的表达后,肿瘤球实验显示细胞的成球能力增强;Western blot实验显示信号通路也发生相应的变化。在CNE2-BART7-3p和5-8F-BART7-3p细胞中转染Smad7（不含3’ UTR）表达载体,即恢复Smad7的表达后,则细胞的成球能力下降,并下调TGF-β信号通路。第四章利用纳米技术构建EBV-miR-BART7-3p的反义核苷酸从而抑制EBV阳性的鼻咽癌细胞的生长方法1、应用纳米技术层层包裹的方法构建携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸（带有绿色荧光）的纳米金颗粒（nano-anti-miR）,同时利用透射电镜及动态光散射检测其形态、稳定性及电位。2、利用激光共聚焦显微镜观察纳米金颗粒的转染效率,并利用qPCR实验进一步验证。3、在EBV 阳性的鼻咽癌细胞中转染携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒,通过一系列体外实验（qPCR、MTT、western blot）检测细胞生长和增殖能力的变化。4、用EBV 阳性的鼻咽癌细胞进行裸鼠皮下注射成瘤后,通过瘤内注射的方法将携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒注射进裸鼠肿瘤内,观察肿瘤生长变化,从而考察其治疗效果。结果1、用层层包裹法构建好带绿色荧光的携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒后,动态光散射（DLS）检测显示大部分粒子的粒径大小均为20-30nm之间;Zeta电位测定表明构建好的gold-PEI的电位值大约为+20mV;透射电镜（TEM）显示nano-anti-miR的形态为类圆形,大小均一,分布均匀。2、激光共聚焦显微镜显示绿色荧光较强,表明携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒的转染成功,效率较高。qPCR实验证实,转染nano-anti-miR后,HONE1-EBV细胞中EBV-miR-BART7-3p表达显著下调。3、在HONE1-EBV细胞中转染nano-anti-miR后,MTT实验显示细胞生长速度减弱;Western blot结果显示,PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达下调。4、将HONE1-EBV细胞注射进裸鼠皮下成瘤后,每隔三天瘤内注射nano-anti-miR,肿瘤生长变慢,体积及重量变小。取肿瘤组织做western blot分析,结果显示PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达下调。结论1、EBV-miR-BART7-3p在鼻咽癌组织中显著高表达,并且与患者的TNM分期和临床分期呈正相关。2、EBV-miR-BART7-3p通过靶向PTEN及调节下游PI3K/Akt/GSK-3 β信号通路进而促进鼻咽癌细胞的转移、侵袭及EMT;3、EBV-miR-BART7-3p通过靶向PTEN及促进转录因子c-Myc和c-Jun的表达影响细胞周期进程从而促进鼻咽癌细胞生的长及增殖。4、EBV-miR-BART7-3p通过靶向抑制Smad7表达及调节下游TGF-β信号通路进而促进鼻咽癌细胞干性,并降低鼻咽癌细胞对化疗药物的敏感性。5、利用纳米技术构建的携带EBV-miR-BART7-3p反义核苷酸的纳米金颗粒可以在体外及体内抑制EBV阳性的鼻咽癌细胞的生长。