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随着生物基因工程的发展,花粉管通道法越来越多地用于植物的遗传转化,在植物的基因工程研究中占重要地位。近年来,在我国转基因棉花研究实践中,主要使用的是农杆菌介导法和花粉管通道法。尤其是我国学者首创的花粉管通道法,被证明是一种十分方便有效的植物转基因技术。对棉花来说,因其花器大,繁殖系数高,尤其适合采用花粉管通道法进行外源DNA导入。花粉管通道技术的关键在于精确掌握受体的受精过程及其时间规律,把握转化时间,使受体能够在最佳感受态下接受外源DNA。以前棉花外源DNA导入的经验时间为授粉后24h左右。但这方面的确切机理尚不清楚,本实验采用常规石蜡切片,对陆地棉的花粉管生长、受精和受精卵分裂过程及花粉管通道形成时期进行研究。结果表明:
(1)授粉后15h花粉管通过珠孔进入胚囊,释放内含物。
(2)48h,始见胚的分裂。72h,可以明显观察到分裂的早期胚。
(3)利用花粉管通道技术进行棉花的遗传转化适宜时间为授粉后18-48h。试验结果为棉花花粉管通道法导入外源基因育种提供一定的依据。更为精确地掌握转化最佳时间提高其进入胚囊的几率等。通过外源标记DNA导入研究能够直接反映不同时期、不同导入方法对导入效果影响。同时也揭示出陆地棉通过花粉管通道法导入外源基因的最佳时间。因此试验采用石蜡切片技术、常规光镜技术、放射活度测量和放射自显影技术,其中采用[α-32P]dATP标记比马S-7品种的DNA,采用花粉管通道法导入科棉1号品种,测量不同时期导入标记DNA在胚珠内的放射活度,探讨陆地棉导导入外源DNA的最佳时期,以及外源DNA在胚珠内的分布情况。结果表明:
(4)不论是通过滴涂还是通过注射方法在棉花授粉后的33h导入DNA在胚珠内的活度测量都是最大的;
(5)滴涂导入方法的活度测量值上明显低于注射方法;在放射自显影观察上,银粒的分布是比较明显的,导入试验的银粒分布远多于对照。综合整个试验,阐明了陆地棉通过花粉管通道法导入外源基因的最佳时间是授粉后33h。