二甲氧苄啶是一种磺胺类抗菌增效剂,与磺胺药联用能从双重机制阻断敏感菌体内叶酸合成、抑制细菌的生长与繁殖,从而发挥优良的抗菌效应。二甲氧苄啶在亚洲地区广泛应用于防治禽球虫病及畜禽肠道感染等,其单独应用也具有防治球虫的作用。代谢与残留研究是食品动物用药后食品安全性评价的核心内容,而二甲氧苄啶代谢与残留的相关研究迄今未见文献报道,二甲氧苄啶的食品安全性标准缺乏。放射性同位素具有高特异性、灵敏度高和易检测性等优点,能准确地对标记物在机体内进行定位,被广泛应用于医药学领域,用以揭示药物的在机体内分布、代谢与排泄过程。美国食品和药物管理局(FDA)和欧盟(EU)推荐采用放射性示踪法研究药物在生物体内的代谢、分布和消除。本课题采用放射性示踪与液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(LC/MS-IT-TOF)结合技术,开展了二甲氧苄啶在猪、鸡和大鼠体内的代谢、分布与消除研究,鉴定了二甲氧苄啶在猪、鸡和大鼠体内的代谢物,分析了不同代谢物在不同动物体内的分布和消除规律,确定二甲氧苄啶在猪和鸡体内的残留靶组织和残留标示物,进而为其食品安全性标准的制定提供科学依据。1氚标记二甲氧苄啶的合成与质量研究以3-溴-4,5二甲氧基苯甲醛为起始原料,在甲醇钠的甲醇溶液中与丙烯腈在50℃经Knoevenagel反应得到α-(甲氧基甲基)-3-溴-4,5-二甲氧基肉桂腈;再与碳酸胍在乙醇钠的乙醇溶液中回流反应得到溴代二甲氧苄啶,最后与氚气发生氚卤交换生成最终产物氚标记二甲氧苄啶。分别采用色谱、质谱和核磁共振方法对中间体和终产物进行结构确证。结果发现,α-(甲氧基甲基)-3-溴-4,5-二甲氧基肉桂腈在正离子模式下的离子峰为[M+H]+329;溴化二甲氧苄啶在正离子模式下响应为[M+H]+339及其溴的同位素峰[M+H]+341;氚标记二甲氧苄啶在正离子模式下显示为[M+H]+263.1424,结果与理论值符合。核磁共振氢谱检测表明,原料3-溴-4,5二甲氧基苯甲醛上的溴在苯环的3位上;α-(甲氧甲基)-3-溴-4,5-二甲氧基肉桂腈结构正确;3-溴-二甲氧苄啶结构正确;氚标记的位置即为溴所在的位置,即二甲氧苄啶苯环上的3位,由此证明目标产物为3位定位标记的氚标二甲氧苄啶。采用高效液相色谱法对制备得到氚标记二甲氧苄啶和二甲氧苄啶对照品进行测定,通过面积比较确定氚标记二甲氧苄啶的化学纯度;用液体闪烁计数仪和高效液相色谱联用技术测定其比活度和放化纯度。结果表明,制备得到的氚标记二甲氧苄啶化学纯度≥98%、放化纯度≥98%、比活度为22.08Ci/g,均满足动物实验的需要。2物料平衡和代谢猪4头、鸡和大鼠各6只,按10mg/kgb.w.—次性经口灌胃给予氚标记二甲氧苄啶,比活度为0.23Ci/g。在给药后6h、12h、1d及以后每24h收集尿液和粪便,取一部分样品检测其总放射性活度,直到检测不到放射性为止。根据测定结果,得到二甲氧苄啶在动物体内的排泄规律;另取一部分样品经提取净化后,采用HPLC-ARC和HPLC/MS-IT-TOF对代谢物进行定性定量分析。总的收集时期内,二甲氧苄啶在猪和大鼠的尿液排泄率分别为84.21%和81.25%,粪便中排出11.00%和11.49%。给药后第0.5天,猪、鸡和大鼠排泄率分别为 70.01%、64.95%和 46.91%;第 1 天累积排泄率分别为 78.11%、80.49%和 66.79%;第2天分别为 84.55%、91.06%和 80.35%;第 4 天分别为 90.91%、93.27%和 87.10%;第7天分别为 92.13%、94.46%和 91.30%;第 14 天分别为 92.46%、94.66%和 92.73%;三种动物给药后7d天后药物回收均在90%以上,二甲氧苄啶的排泄较为迅速。猪尿液中检测到原型DVDO和3种代谢物,分别为脱一甲基产物DVD1、脱甲基后与葡萄糖醛酸结合物DVD2和氨基与葡萄糖醛酸结合物DVD4;粪便中检测到了原型DVD0和1种代谢物DVD1;血浆中可检测DVDO、DVD1和DVD2;胆汁中检测到DVD 1和DVD2。鸡粪便中检测到原型DVD0和3种代谢物,分别为DVD1、DVD4和α-C羟基化产物DVD3,血浆中检测到DVDO和少量DVD2,胆汁中检测DVD0和大量DVD2及少量DVD4。大鼠尿液中检测到DVD0、DVD1、DVD2、DVD3和脱甲基后与硫酸结合物DVD5。粪便中能检测到DVD0、DVD1和DVD3,血浆中检测到DVD0、DVD1和DVD2。二甲氧苄啶在三种动物体内的主要代谢途径为:一是苯环脱一甲基;二是苯环脱甲基后与葡萄糖醛酸结合;三是发生α-C羟基化;四是氨基与葡萄糖醛酸结合;五是脱甲基后与硫酸结合。3分布与残留消除28头猪,36只鸡和36只大鼠各自随机分为6(猪7组)组,按10mg/kg b.w.连续7d经口灌胃给药(比活度为0.23Ci/g),在给药后6h、1、3、—7d和14d宰杀(猪为6h、1、3、5d、7d和14d),收集肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脾脏、肌肉、脂肪、胃、大肠、小肠、皮肤等组织以及血浆和胆汁(血浆和胆汁样品主要用于做代谢试验)。收集的样品取少量经消化液水浴消化,静态液闪仪检测其放射活度,确定药物在动物体内各组织中的分布情况;同时采用甲醇或甲醇与三氯甲烷复合试剂对可食性组织样品进行提取净化,LC/MS-IT-TOF与流动液闪联合应用对代谢物进行分离鉴定和定量分析。二甲氧苄啶在猪体内分布广泛。猪连续多次给药后6h各组织中总放射性的含量均很高,其中胆汁的药物浓度最高,达326mg/kg,其次为肾脏、肝脏、膀胱、小肠和肺脏等组织。大多数组织1d后放射性活度迅速下降,胆汁下降约10倍,肾脏下降约20倍,其他大多数组织的放射性活度只有6h的一半左右。3d药物在大多数组织的浓度下降到500μg/kg以下。7d除了肝脏和肾脏,大部分组织中的浓度接近或低于100μg/kg,被毛已不能检出。到第7d时肝脏、肾脏、肌肉和脂肪中检测到较低的放射性活度。给药后14d猪体内组织中检测不到放射性。从肝脏、肾脏、肌肉和脂肪来看,脂肪中的总放射性代谢物含量是最低。6h肝脏中检测到3种放射性物质,包括原型DVD0和2种代谢物(脱一甲基产物DVD1和脱甲基后与葡萄糖醛酸结合物DVD2),到第7d只能检测到原型。6h肝脏中能检测到包括原型DVD0,脱一甲基DVD1和脱一甲基后与葡萄糖醛酸结合物DVD2三种放射性物质,7d只能检测到原型DVD0;肾脏中能检测到4种放射性物质,包括DVD0、DVD1、DVD2和嘧啶环上氨基与葡萄糖醛酸结合物DVD4,7d只能检测到原型DVDO;6h的肌肉和脂肪中检测到2种放射性物质,分别是DVD0和DVD1,7d只能检测到原型DVD0。胆汁中药物消除半衰期不足1天,能迅速代谢;血浆、胃、大肠、被毛、脂肪、胰腺和肾上腺的总放射性残留半衰期在1.40-2.00d之间;心脏、脾脏、肺脏、小肠、皮肤、肌肉和淋巴结的消除半衰期在2.21-2.73d之间,肝脏和肾脏中的总放射性残留消除半衰期相对较长,分别为2.74d和2.90d。总放射性检测结果表明,二甲氧苄啶及其代谢物在肾脏中残留量最高,消除速度最慢,持续时间最长,所以肾脏被确定为残留靶组织。肾脏中DVD0消除最慢,消除半衰期为3.15d,与总放射性消除趋势相似,确定DVD0为残留标示物。鸡多次给药后6h各组织中放射性代谢物的含量均很高,其中胆汁、肾脏和肝脏药物浓度最高,分别达到45595、16089、10555μg/kg,其次为嗉囊、腺胃、大肠、小肠、脾脏和肺脏。停药后1d,绝大多数组织的药物浓度下降一半以上,胆汁浓度依然很高,高达35908μg/kg。3d除了胆汁外,其他组织中浓度均在5000μg/kg以下。7d胆汁种放射性物质浓度迅速下降,为424μg/kg,其他组织均在100μg/kg左右。14d只有肝脏和肾脏检测少量的放射性活度。给药后鸡各组织中二甲氧苄啶谢物及其代谢物的分布与含量发现,原型药物DVD0在各个组织器中均有分布,且在肝脏、肾脏、肌肉和脂肪中持续时间较长。在6h时,各组织中代谢物种类最多。6h肾脏中能测到包括原型的5种放射性物质,到1d时只能测到DVD0和DVD1。肾脏6h-14d的放射性代谢物中绝大多数是原型;肝脏中6h能测到3种放射性物质,除了原型,其他两种代谢物的含量很低,1d之后只能检测到原型;脂肪中,在6h-1d中发现少量的DVD1和大量的原型DVD0;肌肉中,只发现原型。胆汁中药物消除半衰期不足1天;血浆、脾脏、肺脏、胰腺、法氏囊、脑和消化系统消除速度相近,消除半衰期分别为1.27-1.82d;心脏、皮肤和肌肉消除半衰期较长,在2.73-3.06d之间;肝脏和肾脏中的总放射性残留消除半衰期相对最长,分别为3.14d和3.26d。分析总放射性检测结果可知,肾脏是二甲氧苄啶及其代谢物残留量最高,持续时间最长,消除速度最慢的组织,所以肾脏是二甲氧苄啶在鸡体内的残留靶组织。肾脏中DVD0消除最慢,消除半衰期为3.25d,与总放射性的半衰期相近,总体消除趋势相似,因此确定DVD0为残留标示物。二甲氧苄啶在大鼠体内分布广泛,在雌雄大鼠之间,药物主要的分布部位没有显著的差异,药物在组织的浓度有细微的差别,给药后6h各组织中放射性代谢物的含量均很高,其中肾脏、肝脏、肺脏和消化道的放射性含量最高,均在3000μg/kg以上,消除速度较快,第1d大部分组织的药物浓度下降1000μg/kg左右。3d所有组织中的药物浓度均下降到500μg/kg左右。7d大多数组织的浓度在200μg/kg左右。14d只有肝脏和肾脏中有少量药物检出。二甲氧苄啶在雌雄大鼠体内消除差别在0.3d以内。血浆、大小肠和胰腺中药物消除较快,消除半衰期为1.50-2.00d之间,其次为心脏、脾脏、肺脏、胃、膀胱、肌肉和生殖腺等组织,消除半衰期分别为2.05-2.82d之间,肝脏中药物消除速度较慢,肝脏中雌雄大鼠消除半衰期分别为3.65d和3.47d。肾脏中药物消除速度最慢,雌雄大鼠消除半衰期分别为3.87d和3.77d。分析各个组织总放射性测定结果可确定,肾脏中二甲氧苄啶及其代谢物残留量最高,消除速度最慢,持续时间最长。给药后大鼠各组织中二甲氧苄啶及其代谢物的分布与含量发现,原型药物DVD0在各个组织中均有较高浓度的分布,且在肝脏、肾脏、肌肉和脂肪中持续时间最长,消除最慢。本课题首次对二甲氧苄啶进行放射性氚标记,对其质量标准进行了研究和制定,采用放射性示踪和LC/MS-IT-TOF联用技术对其在猪、鸡和大鼠体内的代谢、分布和消除进行了研究,分离鉴定了其在猪、鸡和大鼠体内及排泄物中的代谢产物,对可食性组织肝脏、肾脏、肌肉和脂肪种放射性物质进行了定性定量分析,对总残留和各个代谢物在不同器官中的消除规律进行分析比较,确定了二甲氧苄啶在猪和鸡体内的残留靶组织和残留标示物。研究结果为二甲氧苄啶食品安全风险评估的制定提供了详实的基础数据,同时为揭示二甲氧苄啶的药理与毒性机制提供了科学依据。