论文部分内容阅读
研究背景和目的脓毒症以其高发生率和高死亡率业已成为全球公共卫生的挑战。脓毒症本质上是感染引发的宿主免疫、炎症和凝血机制失调,但由于宿主反应的复杂性和多样性,决定了单一针对脓毒症发病机制中某一关键介质或调控环节的治疗措施效果并不显著,只有从整体上逆转宿主体内免疫反应平衡才能维持重要脏器功能,并有效防治脓毒症。间充质干细胞具有多种生物学效应,能够维系炎症反应、抗炎反应及免疫抑制之间动态平衡,已作为脓毒症生物治疗的潜在策略。然而,移植细胞的作用机制不清,治疗获益有限,严重限制了脓毒症细胞生物学治疗的临床转化。课题针对当前脓毒症细胞治疗机制不明的问题,通过建立盲肠结扎穿孔致脓毒症的小鼠动物模型,分别在整体水平和细胞水平观察骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的治疗作用及对巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs)的抗炎调节作用,阐明BMSCs移植对治疗脓毒症的作用机制,明确脓毒症生物治疗的关键分子靶点,通过机制干预,优化细胞治疗策略。研究方法原代分离、培养、鉴定B6-e GFP转基因小鼠的BMSC及成纤维细胞(Fb),建立盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)模型,术后尾静脉注射盐水、Fb或BMSCs,计算96小时内小鼠生存率,超声心动图测定左室收缩功能,生物技能实验系统检测血流动力学,酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清脏器损伤指标及炎症因子水平,共聚焦显微镜观察BMSCs的归巢情况,苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠脏器组织病理变化,免疫组织化学及免疫荧光染色观察小鼠脏器炎性细胞浸润,Western Blot免疫印迹试验检测组织的蛋白水平。原代分离、培养及鉴定BMDMs,体外LPS和ATP干预并与BMSCs共培养,ELISA检测细胞培养上清炎症因子水平,流式细胞术检测BMDMs线粒体ROS生成,透射电子显微镜观察BMDMs线粒体形态,免疫荧光染色观察NLRP3和LC3B的亚细胞定位,Western Blot检测BMDMs P2X7、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、PINK1、Parkin和LC3B的蛋白水平。研究结果1.观察96h小鼠生存率,脓毒症盐水组小鼠生存率为10%,脓毒症Fb组小鼠生存率为5%,脓毒症BMSCs组小鼠生存率为40%,log-rank检验进行生存率分析结果显示:脓毒症BMSCs组小鼠生存率明显高于盐水组或Fb组,其差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.05),说明BMSCs静脉输注可提高脓毒症小鼠的生存率。2.各脏器组织冰冻切片可见BMSCs较多定植于肝脏;病理切片HE染色可见脓毒症BMSCs组各脏器充血、水肿及炎性细胞浸润减少;ELISA结果显示脓毒症BMSCs组血清中各脏器损伤的生物标志物水平下降;超声心动图结果显示脓毒症BMSCs与脓毒症盐水组和Fb组相比,LVEF,LVFS均明显升高(P<0.05,P<0.05),(P<0.05,P<0.05),血流动力学结果显示与脓毒症盐水组和Fb组相比,注射BMSCs显著改善小鼠心室收缩/舒张功能(与盐水组相比:+dp/dp:P<0.05,-dp/dp:P<0.01;与Fb组相比:+dp/dp:P<0.05;-dp/dp:P<0.05),说明BMSCs辅助治疗改善脓毒症所致心脏功能下降;免疫组织化学和免疫荧光染色可见脓毒症BMSCs组各脏器组织中的中性粒细胞(Ly-6G+细胞)和巨噬细胞(MAC-3+细胞)减少。ELISA结果显示与脓毒症盐水组和Fb组相比,血清IL-1β水平均明显降低(,P<0.01,P<0.05)。血清IL-6、TNF-a水平变化趋势与IL-1β水平变化一致,血清IL-10水平均明显升高(P<0.05,P<0.05);肝脏组织蛋白Western Blot结果显示脓毒症BMSCs组与脓毒症盐水组及Fb组相比,casp-1 p20表达显著下降(P<0.05,P<0.05),IL-1βp17表达显著下降(P<0.05,P<0.05),说明BMSC辅助治疗脓毒症与抑制炎症复合体3的激活有关。3.流式细胞术结果显示BMSCs共培养LPS和ATP刺激组线粒体氧化阴离子(O2-)生成下降,线粒体膜电位上升,说明BMSCs减轻LPS和ATP干预对BMDMs线粒体的损伤;线粒体、NLRP3与细胞核共定位免疫荧光染色结果表明BMSCs改变NLRP3在巨噬细胞中的分布;BMDMs蛋白Western Blot及培养上清ELISA结果显示经过Mito-TEMPO处理后BMSCs共培养LPS和ATP刺激组caspase-1p20及IL-1βp17表达显著下降(P<0.05,P<0.01),IL-1β和IL-18水平显著降低(P<0.05,P<0.05),说明BMSCs对BMDMs的调节作用与其抑制炎症复合体3激活有关,且这个过程可能需要线粒体ROS的参与。4.透射电镜观察显示BMSCs共培养LPS和ATP刺激组线粒体空泡样变减少,线粒体自噬体增加;线粒体、LC3B蛋白与细胞核共定位免疫荧光染色结果表明,BMSCs共培养LPS和ATP刺激组,LC3B由均匀分布转为明显的斑点状聚集,并且与线粒体重合增多,说明BMSC组线粒体自噬加剧;BMDMs蛋白Western Blot及培养上清ELISA结果显示BMSCs共培养LPS和ATP刺激组经过3-MA处理后,caspase-1 p20及IL-1βp17表达显著上升(P<0.01,P<0.05),IL-1β和IL-18分泌显著增多(P<0.05,P<0.05),说明自噬参与了BMSCs抑制BMDMs炎症复合体3激活的调节。5.BMDMs蛋白Western Blot结果显示:BMSCs共培养LPS和ATP刺激组经过Mito-TEMPO处理后PINK1和Parkin表达量以及LC3BⅡ/Ⅰ比例显著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.01),说明BMSCs经由PINK1/Parkin途径增加LPS和ATP干预后BMDMs的线粒体自噬,且这个过程可能需要线粒体ROS的参与;流式结果显示3-MA干预后的BMSCs共培养LPS和ATP刺激组线粒体释放ROS增多,说明BMSC通过增加LPS和ATP刺激后BMDMs的线粒体自噬,减少线粒体ROS的生成。研究结论1.发现BMSCs辅助治疗能够提高脓毒症小鼠生存率;减轻脓毒症所致重要脏器的病理损伤,改善脓毒症所致重要脏器的功能,改善脓毒症所致心脏功能下降;减轻脓毒症所致重要脏器炎性细胞浸润,降低脓毒症血清炎症因子水平,证实了BMSCs辅助治疗脓毒症的有效性,阐明BMSCs移植对脓毒症小鼠治疗作用的机制可能与其抑制炎症复合体3的激活有关。2.发现BMSCs通过PINK1/Parkin途径增加LPS和ATP干预后BMDMs的线粒体自噬,减少线粒体的损伤和ROS产生,从而抑制炎症复合体3的激活,阐明了BMSCs与巨噬细胞相互作用与激活炎症复合体3之间的关系,明确了脓毒症生物治疗可能存在的分子靶点。