中药化学成分复杂,具有多重药理活性,其固有的“多成分,多靶点”的特征,决定了中药材需要建立具有特征性和专属性的质量和生物活性评价体系。课题组前期已经对蟾酥鲜浆的物质基础和质量控制开展了研究。蟾酥鲜浆经过干燥加工制成蟾酥药材(片酥),进而酒制粉碎后制成饮片(蟾酥粉)。由于蟾酥价格昂贵,市售商品多有掺伪现象,致使蟾酥药材和饮片质量参差不齐,影响质量稳定以及药效和安全性。为此,本论文研究着重对商品蟾酥药材和饮片进行质控标志物筛选、质量评价和质量标准建立研究。具体内容如下:1.文献研究查阅了中药蟾酥的相关文献,了解到蟾酥的主要作用,中医古方中蟾酥主要用于抗炎,现代研究蟾酥逐渐应用于抗肿瘤治疗。蟾酥的成分复杂,主要包括了蟾蜍内酯类、吲哚生物碱类、色胺类、多肽及氨基酸类。对于蟾酥中成分的检测,目前常用的检测手段主要是液相色谱-质谱联用的技术。本章的第一部分主要介绍了基于质谱技术的中药化学成分的检测和鉴定以及活性标志物的筛选方法,第二部分介绍了目前中药质量控制和评价的方法及现状。2.基于PLS分析对蟾酥高分辨质谱文件的抗肿瘤细胞标志物筛选利用PLS多维统计分析-二维高分辨质谱法筛选抗肿瘤细胞活性标志物,并基于亲和原理的离心超滤-质谱法及非变性色谱-质谱法确证蟾酥标志物与大分子蛋白的结合活性。(1)蟾酥甲醇提取物AB SCIEX Triple-TOF 5600高分辨质谱文件的重新分析蟾酥甲醇提取物AB SCIEX Triple-TOF 5600高分辨质谱文件的重新分析结果显示,蟾酥中含有丰富的蟾蜍甾烯类成分以及蛋白、多肽等,与课题组前期研究结果基本一致。采用AB SCIEX Triple-TOF 5600高分辨质谱对蟾酥甲醇提取物中的小分子甾烯及大分子多肽进行鉴定分析。结果显示,蟾酥中含有丰富的蟾蜍甾烯类成分,包括游离型和精氨酸有机酸酯结合型蟾蜍甾烯及蛋白、多肽等,与之前研究结果过基本一致,依据其二级质谱裂特征性和裂解规则,可以有效鉴定并识别。(2)基于PLS(偏最小二乘法)多维分析-二维高分辨质谱法筛选抗肿瘤细胞相关标志物课题组前期建立了一种基于pearson相关系数法-二维色谱质谱筛选抗肿瘤细胞活性标志物。该方法简便易行,但是pearson相关分析是单因素相关分析,没有考虑蟾酥含有的复杂多元化学成分,同时pearson相关也未能考虑到多元成分间的交互作用。为此本节研究采用PLS多元统计分析方法,解决上述问题,进而从蟾酥复杂的次生代谢产物中寻找并鉴定其抗肿瘤细胞活性相关标志物,用于蟾酥商品的质量控制。结果表明,利用PLS多元统计分析筛选出来的抗肿瘤细胞活性标志物与课题组前期利用pearson相关性所筛选出来的标志物有80%重合率,表明该方法可行。(3)基于离心-超滤质谱及离子交换色谱法研究活性标记物进一步研究了蟾蜍甾烯标志物与肿瘤细胞总蛋白的结合活性。以DHFR/MTX作为阳性对照,考察蟾蜍甾烯类成分与SMMC-7721肝癌细胞总蛋白之间的结合关系。采用离子交换液相色谱将目标药物与SMMC-7721总蛋白孵育后分段收集馏分,收集到的馏分进行质谱检测,对SMMC-7721总蛋白与8种蟾蜍甾烯化合物的结合研究显示:对照组药物主要集中在Fr.4,少部分在Fr.11、Fr.14;而对应的药物-蛋白组中检测到的药物主要集中在Fr.56。基于上述结果,初步判断蟾蜍甾烯类成分能够与肿瘤细胞SMMC-7721蛋白发生结合。在上述研究基础上,采用基于亲和原理的离心-超滤质谱法筛选目标靶蛋白与活性配体小分子的结合。利用三组已知蛋白及其配体作为阳性对照建立离心-超滤质谱法。结果表明该方法能够识别已知的目标蛋白和活性配体,也适用于筛选或确证针对某一目标靶点蛋白的活性小分子配体。我们利用该方法初步表明质控标志物蟾毒灵(bufalin)能够与两个潜在的抗骨髓瘤靶点发生结合,表明该类成分是蟾酥的活性物质。此外,蟾蜍甾烯类标志物除了具有抗肿瘤细胞作用外,也抑制了脂多糖刺激的淋巴细胞增殖,具有抗炎活性。鉴于该类成分对蟾酥的活性贡献,我们以其为标志物对蟾酥商品进行质量评价研究3.不同批次蟾酥商品药材的品质评价本部分研究优化蟾酥中蟾蜍甾烯类成分的检测方法,对不同批次蟾酥商品与雷允上基地蟾酥样品进行了含量测定。分析了不同批次蟾酥样晶体外抗肿瘤活性与经权重系数矫正前后的含量之间的相关性,表明所建立的质量评价方法能够反应蟾酥质量优劣。(1)蟾酥定性、定量检测方法的优化在现行2015版中国药典方法基础上,对蟾酥薄层定性检测及高效液相色谱定量检测方法进行优化。定性鉴别方法考察并优化了包括样品浓度、点样量、预平衡与预饱和方式、展距等指标。定量检测考察并优化了包括色谱柱、流动相组成、梯度、流速、进样量等指标。(2)蟾酥质量评价方法的建立及蟾酥商品的品质评价对43批蟾酥商品进行了含量测定和抗肿瘤细胞活性评价,采用PCA分析,表明不同来源和批次蟾酥商品甾烯含量存在较大差异,批间一致性差。考虑到两种甾烯成分(药典方法)不能全面反映蟾酥质量的优劣,而6种蟾蜍甾烯的总含量可能更适于蟾酥质量评价。分析上述研究结果,发现不同批次蟾酥的蟾蜍甾烯含量与其抗肿瘤细胞间的相关系数介于-0.28～0.4之间,表明单个的甾烯成分含量与抗肿瘤活性间不具有显著相关性;我们进而设计了基于活性贡献的权重系数校正,发现校正后的蟾蜍甾烯总含量与其抗肿瘤细胞间的相关系数为0.56,具有相关性。因此,采用校正后的蟾蜍甾烯总含量为指标可以较好的反应蟾酥品质优劣。(3)一测多评法与直接测定法的比较为减低大批量含测对甾烯标准品的消耗,我们以华蟾酥毒基为内参物,采用一测多评的方法实现了对蟾酥中其它5种甾烯的相对定量检测,分析结果准确可靠,可方便用于制药企业对蟾酥商品的质量检验附录:蟾酥药材等级标准编写通则综上所述,为了对商品蟾酥进行质量控制和评价,我们开展了质控标志物的筛选和质量控制的方法研究。建立了蟾酥商品的质量评价方法及质量标准草案,对蟾酥的质量控制提供科学依据。